הסרט מציג את סיפורו של פיטר פארקר, נער לא אהוב על בני גילו, כמי שרוכש את כוחות העכביש שלו בתקופת התיכון. הוא מצטיין בתחום המדעים. פיטר, יתום מאב ואם, גר אצל דודו בן ודודתו מיי. יום אחד מגלה פארקר כי אביו היה מדען מבריק בתאגיד בשם "אוסקורפ". פיטר מנסה לתור אחר חברו של אביו ועד מהרה פוגש את ד"ר קורט קונורס, מדען קטוע יד ושותפו של אביו, במהלך סיור באוסקורפ. באותו סיור, פיטר ננשך על ידי עכביש מהונדס גנטית ורוכש כוחות על-טבעיים.
לאחר ריב עם דודיו, פיטר בורח למכולת שכונתית ונתקל ברוצח שכיר. הוא עוזר לו שלא ביודעין להימלט, אך פיטר מתחרט על כך לאחר שדודו נרצח על ידי הרוצח. הוא חש אשמה על כך שיכול היה לעצור זאת ומשתמש בכוחותיו ללוחמה בפשע תחת הזהות הסודית ספיידרמן. לאחר ארוחה משותפת עם גוון סטייסי, חברתו לספסל הלימודים, בביתה (בה פיטר רב עם אביה לגבי מהות ספיידרמן בניו יורק וייצוגו), פיטר מגלה לגוון שהוא ספיידרמן, והשניים מתאהבים. במקביל, פיטר נפגש עם ד"ר קונרוס ועוזר לו לפתח נוסחאות, שאמורות לעזור לד"ר קונרוס לרפא את ידו הקטועה. לאחר מספר ניסויים כושלים, מצליחים השניים לפתח וירוס מתאים.
קורט לוקח לעצמו את הווירוס על מנת לרפא את ידו, אך דבר כלשהו משתבש, וקורט מתרפא, אך בו זמנית הופך ללטאת ענק שרוצה להרוס את העיר ולזרוע את הווירוס ברחבי העיר על מנת להפוך את כולם למשרתיו. על ספיידרמן כעת להציל את כל מי שהוא אוהב, ללחום נגד הלטאה ולהציל את העיר מאובדן כללי.
(הסרט מסתיים בסצנת CGI בה רואים את ספיידרמן מתעופף בעזרת קורי העכביש מעל העיר ניו יורק)
בסצנה שלאחר הכתוביות קורט קונורס בכלא וחברו מדבר איתו על פיטר.
בחודש מאי 2012, חשפה חברת סוני פרטים על הפסקול של הסרט. וב תיאר את האות המוזיקלית של הורנר כמדהימה. וב אמר: "רציתי ליצור פסקול שמרגיש מאסיבי אבל גם אינטימי וקטן".
כל המוזיקה של הסרט נכתבה והולחנה בידי ג'יימס הורנר.
אז סוני קיימה אודישנים לתפקיד פיטר הצעיר, שהיה צריך להידמות לגארפילד. ווב אמר, "אני חושב שראינו את מקורו של ספיידרמן לפני כן אך לא את מקורו של פיטר פארקר". ווב הרגיש שכשאתה מנסה לבנות את הסרט אתה חייב לבנות את הגיבור מהיסוד. לכן הוא רצה שפארקר יתחיל בילדותו.
