תהליך יצירת דנ"א רקומביננטי, שבוו מוכנס מקטע דנ"א זר לפלסמיד שמשמש כוקטור
דנ"א רקומביננטי (Recombinant DNA; rDNA) הוא מולקולת DNA שנוצרה באופן טבעי או תוכננה במעבדה - כתוצאה מצירוף (קומבינציה) מחדש (רה) של מקטעי DNA ממקורות שונים, לרוב ממינים שונים של אורגניזמים.
מולקולות דנ"א רקומביננטי מיוצרות לרוב בשיטות מעבדה של התערבות גנטית (כמו שיבוט מולקולרי), על מנת לחבר חומר גנטי ממספר מקורות שונים, ויצירת רצפים גנטים אשר לא היו יכולים להתקיים ביצורים חיים ללא התערבות זו. מולקולות דנ"א רקומביננטי לפעמים נקראות "דנ"א כימרי", כיוון שהן לרוב עשויות מחומר גנטי של שני יצורים שונים. רצפי הדנ"א המשמשים לבניית דנ"א רקומביננטי יכולים להיות במקורם מכל יצור או זן. לדוגמה, דנ"א צמחי יכול להצטרף לדנ"א של בקטריה, או למשל דנ"א אנושי יכול להצטרף לדנ"א של פטרייה. בנוסף, רצפי דנ"א שלא קיימים בשום מקום בטבע יכולים להיווצר על ידי הסינתזה הכימית של דנ"א, ולהשתלב יחד לדנ"א רקומביננטי.
חלבון אשר נוצר כתוצאה מהופעת הדנ"א הרקומביננטי שבתוך התאים, נקרא חלבון רקומביננטי. כאשר דנ"א רקומביננטי המקודד חלבון מוצג ליצור המארח, החלבון הרקומביננטי לא תמיד ייווצר. היווצרות חלבונים כתוצאה מביטוי לחלבונים זרים דורש שימוש בוקטורי ביטוי מיוחדים ולעיתים קרובות על גוף היצור לעשות ארגון מחדש של הרצף הגנטי שלו על מנת לייצר את החלבון הזר.
טכנולוגיית הדנ"א הרקומביננטי משתמשת ברצפים פלינדרומים. דנ"א רקומביננטי שונה משילוב גנטי בכך שהאחרון משתמש בשיטות מלאכותיות בתוך מבחנה, בעוד שדנ"א רקומביננטי הוא תהליך ביולוגי המתבסס על שילוב של דנ"א הקיים באופן טבעי אצל יצורים חיים.
יצירת דנ"א רקומביננטי
שיבוט מולקולרי הוא תהליך מעבדה שבו משתמשים על מנת ליצור דנ"א רקומביננטי. זוהי אחת ממגוון שיטות קיימות, כמו תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) המשמשת לבקר את השכפול של כל רצף דנ"א ספציפי. השוני העיקרי בין שתי השיטות הללו הוא ששיבוט מולקולרי כולל שכפול של הדנ"א בתוך תא חי, בעוד ש-PCR משכפל דנ"א במבחנה, ללא תאים חיים.
ייצור של דנ"א רקומביננטי דורש וקטור שיבוט, מולקולת דנ"א אשר משתכפלת בתוך תא חי. וקטורים לרוב נגזרים מפלסמידים או מווירוסים, ומייצגים יחסית חלק קטן של דנ"א הכולל אותות נחוצים לשכפול גנטי, כמו גם אלמנטים נוספים המאפשרים החדרת דנ"א זר. בחירת הווקטור לשיבוט המולקולרי תלוי בבחירת היצור המארח, גודל הדנ"א המשובט, והאם ואיך על הדנ"א הזר להתבטא. חלקי הדנ"א יכולים להיות משולבים על ידי שימוש במגוון שיטות, כמו הגבלת האנזים או "הרכבת גיבסון".
בפרוטוקולים סטנדרטיים של שיבוט, השיבוט של כל קטע דנ"א כרוך בשבעה צעדים:
בחירה של יצור מארח ווקטור שיבוט
הכנת וקטור הדנ"א
הכנת הדנ"א למצב של שיבוט
יצירת דנ"א רקומביננטי
הצגה של הדנ"א הרקומביננטי ליצור המארח
בחירה של יצורים המכילים דנ"א רקומביננטי
סריקת השיבוטים עם ה-דנ"א הרצוי והמאפיינים ביולוגיים.
ביטוי של דנ"א רקומביננטי
לאחר השתלה לתוך האורגניזם המארח, הדנ"א הזר המוכל בתוך ה-DNA הרקומביננטי עשוי או עשוי שלא, לבוא לידי ביטוי. ייתכן כי הדנ"א פשוט ישוכפל ללא ביטוי, או שהוא יעובד ויתורגם כך שהחלבון הרקומביננטי ייווצר. באופן כללי, ביטוי של גן זר דורש בנייה מחדש של הגן, כך שיכלול רצפים הדרושים לייצור מולקולת mRNA היכולה להיות בשימוש על ידי מנגנון התרגום של המארח. שינויים ספציפיים לאורגניזם המארח יכולים להיעשות על מנת לשפר את הביטוי של הגן. בנוסף, ייתכן כי יתבצעו שינויים נוספים לרצף קידוד, על מנת לשפר את התרגום, להפוך את החלבון למסיס, לכוון את החלבון רקומביננטי למיקום התאי/החוץ-תאי הנכון ולייצב את החלבון.
מאפייני אורגניזמים המכילים דנ"א רקומביננטי
ברוב המקרים, לאורגניזמים הכוללים דנ"א רקומביננטי יש פנוטיפים רגילים. כלומר, ההופעה שלהם, ההתנהגות והמטבוליזם לרוב לא משתנים, והדרך היחידה להראות את קיומו של הדנ"א הרקומביננטי הוא לבדוק את הדנ"א עצמו, לרוב על ידי בדיקת PCR. עם זאת, קיימים יוצאי דופן.
אם רצפי ה-rDNA מקודדים גן, אז הופעת ה-RNA או החלבון המיוצרים על ידי הגן הרקומביננטי, ניתנים לאיתור בדרך כלל באמצעות RT-PCR או שיטות נוספות. שינויים פנוטיפים משמעותיים הם יוצאי דופן, אלא אם הגן הרקומביננטי נבחר וקודד על מנת לגרום לפעילות ביולוגית בתא המארח. פנוטיפים נוספים כוללים רעילות לאורגניזם המארח, במיוחד אם הוא מבוטא בתוך תאים או רקמות לא תואמים.
בחלק מהמקרים, לדנ"א רקומביננטי יש השפעות מזיקות גם אם זה לא בא לידי ביטוי. מנגנון אחד שבו זה קורה הוא הכנסת אי-אקטיבציה insertional, שבו rDNA מוכנס לתוך הגן של התא המארח. בחלק מן המקרים, חוקרים משתמשים בתופעה הזו כדי "לשכנע" את הגנים להחליט מהו התפקיד הביולוגי שלהם וחשיבותם. מנגנון נוסף שבו הכנסת rDNA לתוך DNA כרומוזומי יכול להשפיע על ביטוי גנטי הוא על ידי הפעלה בלתי מתאימה של גנים בתאים קודמים שאינם מבוטאים. מנגנון זה יכול להתרחש, למשל, כאשר חלק של DNA רקומביננטי הכולל יוזם פעיל ממוקם לצד גן תא מארח שקט, או כאשר גן התא המארח הפועל כדי לרסן את הביטוי הגנטי, עובר תהליך של אי-אקטיבציה על ידי ה-DNA הרקומביננטי.
שימושי טכנולוגית דנ"א רקומביננטי
דנ"א רקומביננטי נמצא בשימוש רחב בביוטכנולוגיה, ברפואה ובמחקר. כיום, חלבונים רקומביננטים ותוצרים אחרים של דנ"א רקומביננטי נמצאים כמעט בכל בית מרקחת, מעבדת מחקר או מעבדה רפואית. בנוסף, אורגניזמים אשר עברו טיפולים בשימוש דנ"א רקומביננטי, וכן תוצרים שנגזרו מן היצורים הללו, מצאו את דרכם לחוות, לסופרמרקטים, לחנויות טבע ואפילו לחנויות לבעלי חיים.
השימוש הנפוץ ביותר של דנ"א רקומביננטי הוא במחקר בסיסי, בו הטכנולוגיה הזו חשובה לעבודה היומיומית העדכנית בביולוגיה ובביו-רפואה. דנ"א רקומביננטי משמש לזיהוי, מיפוי וסידור גנטי, וכן כדי להחליט על התפקוד הגנטי. בדיקות דנ"א רקומביננטי משמשות גם לניתוח הביטוי הגנטי בתאים ספציפיים, וכן ברקמות שונות של אורגניזמים. חלבונים רקומביננטים משמשים באופן נרחב כמגיבים בניסויי מעבדה, כמי שמסייעים בבדיקות נוגדנים וכבסיס לבדיקת סינתזת חלבונים בתוך התאים.
כימוזין רקומביננטי
נמצא ברנט, כימוזין הוא אנזים הדרוש לייצור גבינה. זה היה המאכל המהונדס הגנטי הראשון שהיווה תוסף בשימוש מסחרי. באופן מסורתי, נוהגים לייצר כימוזין מרנט, אשר נגזר מהחלב. מדענים הנדסו שרשרת לא פתוגנית (K12) של בקטריית אי-קולי בשביל ייצור מעבדה נרחב של האנזים. המיקרוביולוגיה הזו ייוצר אנזים רקומביננטי, בעל זהות מבנית לאנזים העגל, עולה פחות, ומיוצרת בכמויות נרחבות. כיום, בערך 60 אחוז מהגבינות הקשות בארצות הברית מיוצרות עם כימוזין מהונדס גנטית. ב-1990, ה-FDA הגדיר את הכימוזין בסטטוס -"באופן כללי מוכר כבטוח", בהתבססות על מידע שהראה כי האנזים בטוח לשימוש.
אינסולין אנושי רקומביננטי
אינסולין זה החליף כמעט לחלוטין את האינסולין שהופק מבעלי חיים, לטיפול בסוכרת תלוית אינסולין. מגוון של אינסולינים רקומביננטים נמצא בשימוש רחב. אינסולין רקומביננטי מסונתז על ידי הכנסת גן אינסולין אנושים לתוך חיידק אי-קולי, או לתוך שמרים, אשר לאחר מכן מפיקים אינסולין לשימוש אנושי.
מיועד לשימוש של מטופלים אשר בלוטת יותרת המוח שלהם אינה מייצרת כמות מספקת של הורמוני גדילה והתפתחות. לפני ש-HGH רקומביננטי הפך לזמין, HGH לשימוש טיפולי הופק מבלוטות יותרת המוח של גוויות. השיטה הלא בטוחה הזו הובילה להתפתחות מחלת קרויצפלד-יעקב אצל חלק מהמטופלים. HGH רקומביננטי מנע את הבעיה הזו, ועכשיו משמש לטיפול נרחב בבעיות גדילה. כמו כן נעשה ב-HGH הרקומביננטי שימוש לרעה על ידי ספורטאים ואחרים.
חלבון קרישת דם המסופק למטופלים הסובלים מבעיות בקרישת הדם כמו המופיליה, שאינם מסוגלים לייצר את גורם 8 בכמויות מספקות לשם קרישת דם תקינה. לפני התפתחות הגורם ה-8 הרקומביננטי, החלבון היה מתקבל על ידי עיבוד כמויות גדולות של דם אנושי מתורמים רבים, שיטה אשר גרמה לסיכון גבוה מאוד של העברת מחלות זיהומיות בדם הנישא, כמו איידס וצהבת.
חיסון צהבת רקומביננטי
אינפקצית הפטיטיס B (צהבת) נמנעת על ידי שימוש בחיסון רקומביננטי להפטיטיס B, אשר כולל אנטיגן של הפטיטיס B המיוצר בתאי שמרים. פיתוח החיסון הרקומביננטי היה התפתחות חשובה והכרחית כיוון שווירוס הפטיטיס B, בשונה מווירוסים נפוצים נוספים (כמו פוליו), אינם יכולים לחיות במבחנה.
אבחון HIV
כל אחת משלוש השיטות המשמשות לאבחון נגיף HIV פותחו על ידי שימוש בדנ"א רקומביננטי. מבחן הנוגדנים (אליסה) משתמשים בחלבון HIV רקומביננטי לשם איתור הופעת נוגדנים שהגוף ייצר כתגובה לנגיף ה-HIV. מבחן ה-DNA מחפש הופעה של החומר הגנטי של HIV על ידי שימוש בתגובת שרשרת הפוכה. התפתחות של בדיקת RT-PCR נעשה אפשרי על ידי השיבוט המולקולרי וניתוח הרצפים של הגנום של HIV.
אורז מוזהב
מגוון סוגי אורז רקומביננטי הונדסו לבטא את האנזימים האחראיים לβ-קרוטן ביוסינתזה. המגוון הזה של אורז מכיל תקווה להפחית את מספר המקרים של מחסור בוויטמין A בעולם. אורז מוזהב לא נמצא כיום בשימוש.
גידולים עמידים בפני קוטלי עשבים
מגוון זנים מסחריים של גידולים חשובים חקלאיים (כולל סויה, תירס, סורגום, קנולה, אספסת וכותנה) פותחו על ידי גן רקומביננטי שמביא לחסינות בפני גלייפוסט, קוטל העשבים. גידולים אלה נמצאים בשימוש מסחרי נפוץ במספר מדינות.
יבול עמיד מחיידקים
Bacillus thuringeiensis (מתג) הוא בקטריה אשר מייצרת חלבון (Bt toxin) עם תכונות של קוטל חרקים. הבקטריה הוספה לגידולים כאסטרטגיה למלחמה בחרקים במשך שנים רבות, ומנהג זה אומץ באופן נרחב בחקלאות ובגינון. לאחרונה, צמחים פיתחו באופן ישיר את הסוג של החלבון הרקומביננטי הזה של הבקטריה, דבר שייתכן ויעזור להאבק בחרקים. נושאים סביבתיים הקשורים לשימוש בגידולים מהונדסים אלו, לא נפתרו במלואם.
היסטוריה של דנ"א רקומביננטי
הרעיון של דנ"א רקומביננטי הוצע לראשונה על ידי פטר לובן, תלמיד בוגר של פרופסור דייל קייסר בבית ספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. הפרסומים הראשונים המתארים את הצלחת הייצור ושכפול התאים בטכנולוגיית ה-DNA הרקומביננטי הופיעו בשנת 1972 ו-1973. אוניברסיטת סטנפורד הגישה בקשה לפטנט בארצות הברית על ה-DNA הרקומביננטי בשנת 1974, המפרטת את שמות הממציאים כסטנלי נ. כהן והרברט וו. בויאר; פטנט זה התקבל בשנת 1980. התרופה המורשת הראשונה שנעשה בה שימוש בדנ"א רקומביננטי, הייתה אינסולין אנושי.
מחלוקות
מדענים המוכרים עם הפיתוח הראשון של שיטות הדנ"א הרקומביננטי זיהו שקיימת אפשרות כי אורגניזמים המכילים דנ"א כזה יהיו בעלי תכונות מסוכנות ולא רצויות. ב-1975, בכנס "אזילומר" על דנ"א רקומביננטי, הדאגות הללו עלו לדיון והוחלט להקפיא את מחקרי ה-DNA הרקומביננטי שנחשבו מסוכנים במיוחד. הקפאה זו נצפתה באופן רחב עד של המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) פיתחה חוקים ברורים לעבודה עם דנ"א רקומביננטי. כיום, מולקולות דנ"א רקומביננטי וחלבונים רקומביננטים לא נחשבים מסוכנים. בכל אופן, קיימות דאגות בנוגע לאותם אורגניזמים מיוחדים, במיוחד כאשר הם עוזבים את המעבדה ומוצגים לסביבה או לשרשרת המזון. דאגות אלו מועלות לדיון בכתובות על גנטיקה ובדיונים רפואיים.
