A ribonuclease pancreática bovina converteuse nun sistema modelo común no estudo de proteínas principalmente porque era extremadamente estable e podía purificarse en grandes cantidades. Na década de 1940 Armour and Company purificou un quilogramo da proteína, o que era unha gran cantidade, especialmente para os estándares de purificación de proteínas daquel tempo, e ofreceu mostras a baixo custo aos científicos interesados.[4] A capacidade de ter un só conxunto de encimas purificados fixo desta proteína un sistema modelo predominante para estudos de proteínas. Adoitaba denominárselle ribonuclease A ou RNase A como o membro máis prominente da súa familia de proteínas, coñecida tamén como ribonuclease pancreática ou ribonuclease I.
A RNase A foi o primeiro encima para o cal se propuo un mecanismo catalítico correcto, mesmo antes de que se decubrise a sua estrutura.[6] A RNase A foi a primeira proteína que mostraba os efectos de isomerizacións non nativas de enlaces peptídicos que preceden a residuos de prolina no pregamento de proteínas.[7]
Diagrama de fitas etiquetado da ribonuclease A pancreática bovina (PDB7RSA). O esqueleto molecular de fitas da proteína está coloreado do azul (N-terminal) ao vermello (C-terminal). As cadeas laterais das catro cisteínas enlazadas por pontes disulfuro móstranse en amarelo, cos átomos de xofre representados como pequenas esferas. Os residuos importantes para a catálise móstranse en maxenta.
A RNase A é unha proteína relativamente pequena (124 residuos, ~13,7 kDa). Pode caracterizarse como unha proteína de dúas capas α + β cunha profunda fenda para a unión co substrato ARN. A primeira capa está composta por tres hélices alfa (residuos 3-13, 24-34 e 50-60) da metade N-terminal da proteína. A segunda capa consiste en tres forquitas β (residuos 61-74, 79-104 e 105-124 desde a metade C-terminal) dispostas en dúas láminas β. As forquitas 61-74 e 105-124 forman unha folla β antipralela de catro febras, que se sitúa sobre a hélice 3 (residuos 50-60). A forquita β 79-104 máis longa asóciase cunha fibra β curta (residuos 42-45) para formar unha folla β antiparalela de tres febras que descansa sobre a hélice 2 (residuos 24-34).
A RNase A ten catro enlaces disulfuro no seu estado nativo: Cys26-Cys84, Cys58-110, Cys40-95 e Cys65-72. Os primeiros dous (26-84 e 58-110) son esenciais para o pregamento convencional; cada un deles une unha hélice alfa da primeira capa a unha folla β da segunda capa, formando un pequeno núcleo hidrófobo na súa veciñanza. Os últimos dous enlaces disulfuro (40-95 e 65-72) son menos esenciais para o pregamento; ambos poden ser reducidos (pero non ambos á vez) sen afectaren a estrutura nativa en condicións fisiolóxicas. Estes enlaces disulfuro conectan segmentos bucle e están relativamente expostos ao solvente. O enlace disulfuro 65-72 ten unha propensión moi grande a formarse, significativamente máis do que sería de esperar pola súa entropía de bucle, tanto como péptido coma na proteína na súa lonxitude completa. Isto suxire que a forquita β 61-74 ten unha alta propensión a pregarse conformacionalmente.
A RNase A é unha proteína básica (pI = 9,63); as súas moitas cargas positivas son consistentes coa súa unión ao ARN, o cal é un polianión. Máis xeralmente, a RNase A adoita ser máis polar do habitual ou, mellor dito, cunha infrecuente carencia de grupos hidrófobos, especialmente dos alifáticos. Isto pode explicar a súa necesidade de ter catro enlaces disulfuro que estabilicen a súa estrutura.
O baixo contido hidrófobo pode tamén servir para reducir a repulsión física entre os grupos altamente cargados (os seus propios e os dos seu substrato ARN) e rexións da baixa constante dieléctrica (os residuos non polares).
A hélice α N-terminal da RNase A (residuos 3-13) está conectda ao resto da RNase A por un segmento enlazador flexible (residuos 16-23). Como demostrou F. M. Richards, este enlazador porde ser cortado pola subtilisina entre os residuos 20 e 21 sen causar que a hélice N-terminal se disocie do resto da RNase A. O complexo péptido-proteína chámase "RNase S", o péptido (residuos 1-20) chámase "péptido S" e o restante (residuos 21-124) chámase "proteína S". A constante de disociación do péptido S da proteína S é de aproximadamente 30 pM; esta forte unión pode ser aproveitada para a purificación de proteínas ao unir o péptido S a proteínas de interese e pasar unha mestura por unha columna de afinidade coa proteína S unida. [Un péptido C máis pequeno (residuos 1-13) tamén funciona.] O sistema modelo da RNase S tamén foi usado para estudar o pregamento de proteínas ao acoplar o pregamento coa asociación. O péptido S foi o primeiro péptido procedente da proteína nativa que mostrou ter unha estrutura secundaria (intermitente) en illamento (por Klee e Brown en 1967).
A RNase A corta especificamente despois de nucleótidos de pirimidina.[9] Esta clivaxe ten lugar en dous pasos: primeiro, o enlace 3’,5’-fosfodiéster é cortado para xerar un intermediario 2’,3’-fosfodiéster cíclico; segundo, o fosfodiéster cíclico é hidrolizado a un 3’-monofosfato.[10] Pode ser inhibido pola proteína inhibidor da ribonuclease, por ións metálicos pesados, e por complexos uridina-vanadato.[10]
Mecanismo encimático
As cargas positivas da RNase A están principalmente nunha fenda profunda entre dous lobos. O substrato ARN sitúase nesta fenda e é clivado por dous residuos catalíticos de histidina, His12 e His119, para formar un intermediarios 2',3'-fosfato cíclco que é estabilizado pola Lys41 próxima.
↑Marshall, G. R.; Feng, J. A.; Kuster, D. J. (2008). "Back to the future: Ribonuclease A". Biopolymers90 (3): 259–77. PMID17868092. doi:10.1002/bip.20845.
↑Volkin E, Cohn WE (1953). "On the structure of ribonucleic acids. II. The products of ribonuclease action". J. Biol. Chem.205 (2): 767–82. PMID13129256. doi:10.1016/S0021-9258(18)49221-6.
Kartha, G.; Bello, J.; Harker, D. (1967). Tertiary Structure of Ribonuclease. Boston: Nature. ISBN0-12-588945-3.
Scheraga HA, Wedemeyer WJ, Welker E (2001). "Bovine Pancreatic Ribonuclease A: Oxidative and Conformational Folding Studies". Ribonucleases - Part A. Methods in Enzymology 341. pp. 189–221. ISBN9780121822422. PMID11582778. doi:10.1016/S0076-6879(01)41153-0.
