Estrutura da cápside do fago ΦX174Debuxo esquemático dun virión de Sinsheimervirus (tamén chamado Phix174microvirus)
O fi X 174 (ou fiX174, ΦX174, phiX174 ou Escherichia coli ΦX174) é un virusbacteriófago con ADN monocatenario (virus de ADN monocatenario) que infecta a bacteria Escherichia coli, e foi o primeiro xenoma de ADN en ser secuenciado. Este traballo foi completado por Fred Sanger e o seu equipo en 1977.[1] En 1962, Walter Fiers e Robert Sinsheimer xa demostraran que o ADN deste virus era un círculo pechado covalentemente.[2] O gañador do Premio NobelArthur Kornberg usou ΦX174 como modelo para probar que o ADN sintetizado nun tubo de ensaio por encimas purificados podía producir todas as características dun virus natural, dando comezo á idade da bioloxía sintética.[3][4] En 1972–1974, Jerard Hurwitz, Sue Wickner e Reed Wickner e os seus colaboradores identificaron os xenes necesarios para producir os encimas que catalizan a conversión da forma monocatenaria do virus á súa forma replicativa bicatenaria.[5] En 2003, o grupo de Craig Venter informou que o xenoma de ΦX174 foi o primeiro en ser completamente ensamblado in vitro a partir de oligonucleótidos sintetizados.[6] A partícula vírica completa de ΦX174 foi tamén ensamblada con éxito in vitro.[7] En 2012 demostrouse como o seu xenoma moi solapado pode ser completamente descomprimido e aínda segue sendo funcional.[8]
Xenoma
Xenoma do bacteriófago ΦX174 mostrando os seus 11 xenes.[9]
Este bacteriófago ten un xenoma de ADN circular monocatenario con sentido [+] de 5.386 nucleótidos.[9] O contido GC do xenoma é do 44% e o 95% dos nucleótidos pertencen a xenes codificantes. Debido ao padrón de bases equilibrado do xenoma, utilízase como ADN control para os secuenciadores de Illumina.
Xenes
O ΦX174 codifica 11 xenes, nomeados coas letras consecutivas do alfabeto pola orde en que se descubriron, coa excepción do A*, que é un codón de inicio alternativo dos grandes xenes A. Soamente os xenes A* e K se cre que non son esenciais, aínda que hai algunhas dúbidas sobre A*, porque o seu codón de inicio podería ser cambiado a ATT pero non a ningunha outra secuencia.[10] Sábese que co ATT probablemente aínda pode producir proteínas[11] dentro de E. coli e, por tanto, este xene pode ser, de feito, esencial.
A primeira metade do xenoma de ΦX174 presenta altos niveis de solapamento de xenes,[12] porque 8 dos 11 xenes están solapados en polo menos un nucleótido.[1] Estes solapamentos está demostrado que non son esenciais,[8] aínda que o fago refeito con todos os solapamentos de xenes eliminados ten unha menor fitness respecto ao tipo silvestre.[13]
O fago ΦX174 foi utilizado para tratar de establecer a información xenética non descuberta por unha estratexia de "proba por síntese".[14]
Transcritoma
En 2020, xerouse o transcritoma de ΦX174.[15] Características notables deste transcritoma son unha serie de ata catro promotores relativamente débiles en serie con ata catro terminadores (intrínsecos) independentes de Rho e un terminador dependente de Rho.
Fai unha amosega no ADN da forma replicativa (RF) para iniciar a replicación en círculo rodante; liga extremos do ADN do fago linear para dar lugar ao ADN circular monocatenario
A*
—
Inhibe a replicación do ADN da célula hóspede; bloquea o fago superinfectante; non esencial
A infección empeza cando a proteína G do virus se une aos lipopolisacáridos da superficie da célula hóspede bacteriana. A proteína H (ou proteína piloto do ADN) pilota o paso do xenoma viral a través da membrana bacteriana de E. coli[17] máis probablemente por medio dunha hélice do dominio transmembranaN-terminal predito.[18] Porén, a proteína H é unha proteína multifuncional.[19] Esta é a única proteína da cápside viral de ΦX174 que carece de estrutura cristalina por un par de razóns. Ten un contido aromático baixo e un alto contido de glicina, facendo que a estrutura da proteína sexa moi flexible e ademais, os átomos individuais de hidróxeno (o grupo R das glicinas) son difíciles de detectar en cristalografía de proteínas. Ademais, a proteína H induce a lise do hóspede bacteriano a altas concentracións, xa que a hélice transmembrana N-terminal predita fai facilmente buratos na parede bacteriana. Por medio da bioinformática sábese que esta proteína contén catro dominios superenrolados preditos que teñen unha homoloxía significativa con factores de transcrición coñecidos. Adicionalmente, determinouse que a protreína H de novo era necesaria para a síntese óptima doutras proteínas virais.[20] As mutacións na proteína H impiden a incorporación viral, poden ser superadas cando se proporcionan cantidades en exceso de proteína B, a proteína do armazón interno.
O ADN é exectado a través dunha canle hidrófila.[21] Sábese que a proteína H reside nesta área pero as evidencias experimentais non verificaron a súa localización exacta. Unha vez dentro da bacteria, empeza a replicación do xenoma de ADN monoctenario [+] ([+]ssDNA) por medio dun intermediario de ADN de sentido negativo ([-]ssDNA). Isto faise a medida que o xenoma do fago se superenrola e a estrutura secundaria formada por ese superenrolamento atrae o complexo proteico primosoma. Esta trasládase unha vez arredor do xenoma e conforme pasa sintetízase un ADN monocatemario [−] a partir do xenoma orixinal positivo. Os xenomas de ADN monocatenario [+] que se empaquetarán nos virus créanse a partir deste por un mecanismo de círculos rodantes. Este é o mecanismo polo cal ao xenoma superenrolado bicatenario se lle fai unha amosega na febra positiva por unha proteína A codificada polo virus, atraendo ademais unha ADN polimerase bacteriana (DNAP) ao sito de corte. A ADN polimerase usa a febra negativa como molde para facer o ADN de sentido positivo. A medida que se traslada arredor do xenoma despraza a febra externa do ADN xa sintetizado, o cal é cuberto inmediatemente por proteínas SSBP. A proteína A corta o xenoma completo cada vez que recoñece a secuencia de orixe.
Como o transcrito do xene da proteína é o máis abundante, a principal proteína da procápside viral é tamén a D. De xeito similar, os transcritos de xenes para as proteínas F, J e G son máis abundantes que para a H, xa que a estequiometría para estas proteínas estruturais é 5:5:5:1. Os primosomas son complexos proteícos que se unen ao encima helicase no molde. Os primosomas proporcionan cebadores de ARN ás febras para a síntese de ADN.
Filoxenia e diversidade
ΦX174 está estreitamente emparentado cos Microviridae, especialmente cos fagos NC (por exemplo, NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51, etc.) e máis distantemente emparentado cos fagos similares a G4 e aínda máis distantemente cos fagos similares a α3. Rokyta et al. 2006 presentaron unha árbore filoxenética das súas relacións.[22]
ΦX174 é usado regularmente como un control positivo na secuenciación do ADN debido ao seu tamaño de xenoma relativamente pequeno en comparación con outros organismos e ao seu contido de nucleótidos relativamente equilibrado de aproximadamente 23% G, 22% C, 24% A e 31% T, é dicir, 45% G+C e 55% A+T, ver o acceso NC_001422.1[9] para a súa secuencia de 5.386 nucleótidos. Os instrumentos de secuenciación da compañía Illumina usan ΦX174 como control positivo,[24] e unha soa operación (run) de secuenciación de Illumina pode cubrir o xenoma de ΦX174 varios millóns de veces, facendo que moi probablemente sexa un dos xenoma máis intensamente secuenciado da historia.
ΦX174 tamén foi modificado para permitir a exposición de péptidos (phage display) na proteína G da cápside viral.[26]
Bioloxía sintética
O xenoma de ΦX174 foi o primeiro fago que foi clonado en lévedos,[8] que proporciona un conveniente dique seco no que experimentar con modificacións do xenoma.[27] Foi tamén o primeiro xenoma que se descomprimiu totalmente, eliminando todos os seus solapamentos de xenes.[12] O efecto destes cambios tivo como resultado unha redución significativa da unión ao hóspede, a desregulación da expresión proteica e sensibilidade á calor.[13]
↑Fiers W, Sinsheimer RL (outubro de 1962). "The structure of the DNA of bacteriophage phi-X174. III. Ultracentrifugal evidence for a ring structure". Journal of Molecular Biology5 (4): 424–34. PMID13945085. doi:10.1016/S0022-2836(62)80031-X.
↑National Library of Medicine Profiles in Science. The Arthur Kornberg Papers. "Creating Life in the Test Tube," 1959-1970. link
↑Cherwa JE, Organtini LJ, Ashley RE, Hafenstein SL, Fane BA (setembro de 2011). "In VITRO ASSEMBLY of the øX174 procapsid from external scaffolding protein oligomers and early pentameric assembly intermediates". Journal of Molecular Biology412 (3): 387–96. PMID21840317. doi:10.1016/j.jmb.2011.07.070.
↑ 8,08,18,2Jaschke PR, Lieberman EK, Rodriguez J, Sierra A, Endy D (decembro de 2012). "A fully decompressed synthetic bacteriophage øX174 genome assembled and archived in yeast". Virology434 (2): 278–84. PMID23079106. doi:10.1016/j.virol.2012.09.020.
↑Baas PD, Liewerink H, van Teeffelen HA, van Mansfeld AD, van Boom JH, Jansz HS (xuño de 1987). "Alteration of the ATG start codon of the A protein of bacteriophage phi X174 into an ATT codon yields a viable phage indicating that A protein is not essential for phi X174 reproduction". FEBS Letters218 (1): 119–25. PMID2954853. doi:10.1016/0014-5793(87)81030-x.
↑Fane, Bentley A.; Brentlinger, Karie L.; Burch, April D.; Chen, Min; Hafenstein, Susan; Moore, Erica; Novak, Christopher R.; Uchiyama, Asako (2006). "ɸX174 et al., the Microviridae". En Calender, Richard. The Bacteriophages (2nd ed.). New York: Oxford Univ. Press. p. 130. ISBN978-0195148503.
↑Jazwinski SM, Lindberg AA, Kornberg A (xullo de 1975). "The lipopolysaccharide receptor for bacteriophage phiX174 and S13". Virology66 (1): 268–82. PMID1094681. doi:10.1016/0042-6822(75)90197-x.
↑Cherwa JE, Young LN, Fane BA (marzo de 2011). "Uncoupling the functions of a multifunctional protein: the isolation of a DNA pilot protein mutant that affects particle morphogenesis". Virology411 (1): 9–14. PMID21227478. doi:10.1016/j.virol.2010.12.026.
Goodsell D (febreiro de 2000). "Bacteriophage phiX174". Molecule of the Month. RCSB-PDB. Arquivado dende o orixinal o 02 de decembro de 2013. Consultado o 14 de agosto de 2022.
