کشت سلول

کشت سلول در یک پتری دیش کوچک
یاخته‌های بافت پوششی کشت یافته

کشت سلول (Cell Culture) به فرایند کشت یاخته‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در یک محیط کشت، گفته می‌شود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت یاخته‌های جانداران چندسلولی کاربرد دارد. در این فرایند، یاخته‌ها در محیط آزمایشگاهی یا برون‌تنی (به انگلیسی: in vitro) و تحت شرایط کنترل‌شده، رشد داده می‌شوند. شرایط کشت یاخته‌ای برای هر گونه از جانداران می‌تواند متفاوت باشد. محیط کشت، شامل ظرف کشت و ترکیب پایه (مثلا آگار) است.[۱][۲]

مواد مغذی (مانند اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها و مواد معدنیفاکتورهای رشد و هورمون‌ها به محیط کشت افزوده می‌شوند. از انکوباتور برای تنظیم جو محیط کشت (ترکیب گازهایی مانند دی‌اکسید کربن و اکسیژنفشار و دما در جهت بهینه‌سازی شرایط محیط کشت استفاده می‌شود. هم‌چنین اسیدیته و فشار اسمزی محیط نیز گاهی در فرایند کشت یاخته، با اهمیت تلقی می‌شوند. اکثر یاخته‌ها برای رشد، به یک سطح یا یک بستر مصنوعی (کِشت چسبنده یا تک‌لایه) نیاز دارند در حالی که برخی دیگر توان رشد به‌صورت شناور و آزاد در محیط کشت را دارند.

مفاهیم کشت سلولی پستانداران

جداسازی سلول‌ها

سلول‌ها را می‌توان به چندین روش برای کشت آزمایشگاهی جداسازی کرد. سلول‌های خونی را می‌توان به آسانی از خون استخراج و خالص‌سازی کرد. با این حال، گلبول‌های سفید، تنها سلول‌های خونی قادر به رشد در محیط کشت هستند. سلول‌های تک‌هسته‌ای می‌توانند به‌وسیلهٔ هضم آنزیمی از بافت‌ها آزاد شوند.

از جمله مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در فرایند استخراج، می‌توان به کلاژنازها، تریپسین یا پروناز اشاره کرد که ماتریکس خارج سلولی را می‌شکنند.

سلول‌هایی که به‌طور مستقیم از خود فرد (هدف)، کشت داده می‌شوند به‌عنوان سلول‌های نسل اول (پرایمری) شناخته می‌شوند. اکثر کشت‌های سلولی به جز آن‌هایی که از تومور گرفته می‌شوند، طول عمر محدودی دارند. یک رده سلولی نامیرا می‌تواند با ایجاد جهش تصادفی یا هدفمند (مانند بیان مصنوعی ژن تلومراز) به‌طور نامحدودی تکثیر گردد و به‌عنوان نماینده‌ای از انواع سلولی خاص پایه‌ریزی شود.

حفظ و نگهداری سلول‌ها در محیط کشت

یک بطری حاوی محیط کشت DMEM

اکثر سلول‌های پرایمری پس از این که تا حد خاصی افزایش پیدا کردند، با حفظ ثبات سلولی تحت فرایند پیری قرار گرفته و تقسیم سلولی در آن‌ها متوقف می‌شود. سلول‌ها در یک انکوباتور با دما و مخلوط گازی مناسب (به‌طور معمول دمای ۳۷ درجه و %۵ دی‌اکسید کربن برای سلول‌های جانوری) کشت داده می‌شوند. شرایط کشت برای هر نوع سلول، متفاوت است.

کشت یاخته‌های جانوری باید در محیط کاملاً استریل انجام شود. چون رشد یاخته‌های جانوری بسیار کندتر از رشد باکتری‌ها و مخمرها است و امکان آلودگی وجود دارد. برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها گاهی از آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند پنی‌سیلین، استرپتومایسین یا جنتامایسین استفاده می‌شود. محیط‌های کشت اختصاصی برای رشد یاخته‌های مشخص نیز وجود دارد. مانند محیط کشتی که در آن فقط هپاتوسیت‌ها رشد می‌کنند یا محیط کشت‌هایی که فقط یاخته‌های عصبی که تقسیم نمی‌شوند، می‌توانند زنده بمانند.

برای این‌که یاخته‌ها در محیط کشت، به‌خوبی تکثیر یابند، لازم است تراکم آن‌ها در محیط کشت، در حد محدود و مشخصی باشد. برای این منظور باید هر چند وقت یک‌بار، یاخته‌ها را به محیط کشت‌های تازه جابجا کرد. در صورتی‌که تراکم یاخته‌ها بالا رود، به‌علت ممانعت تماسی، تکثیر یاخته‌ها متوقف شده و یاخته‌ها وارد مرحلهٔ تمایز سلولی می‌شوند.

تعدادی از سلول‌ها مانند سلول‌های موجود در جریان خون می‌توانند بدون هیچ اتصالی به سطح در سوسپانسیون رشد کنند. همچنین برخی از لاین‌های سلولی تغییریافته قادر هستند که در کشت‌های سوسپانسیون زنده بمانند. سلول‌های چسبنده، برای رشد و تقسیم، باید به سطحی مانند پلاستیک کشت بافت یا میکروکریر (ریزحامل) متصل شوند. این سطوح ممکن است به منظور افزایش قابلیت اتصال سلول‌ها و فراهم‌سازی مواد لازم برای رشد و تمایز سلولی، با اجزای ماتریکس خارج سلولی (مانند کلاژن و لامینین) آرایش یافته باشند. بیشتر سلول‌های مشتق‌شده از بافت‌های جامد، چسبنده هستند.

محیط کشت

برای کشت یاخته‌های جانوری از محیط کشت ویژه‌ای استفاده می‌شود. محیط‌های کشت می‌توانند از نظر پی‌اچ، غلظت گلوکز، فاکتورهای رشد و دیگر مواد مغذی با یکدیگر متفاوت باشند. سرم جنین گاوی (FBS)، سرم گوساله گاوی (FCS)، سرم اسب یا سرم بز از جمله معمول‌ترین فاکتورهای رشد مورد استفاده در محیط‌های کشت هستند. یکی از مهم‌ترین عوارض استفاده از مواد مشتق شده از خون در کاربردهای بیوتکنولوژی پزشکی، آلوده شدن محیط کشت به ویروس‌ها و پریون‌ها است. راه‌حل‌های جایگزین، شامل یافتن منابع خون حیوانی از کشورهایی با کمترین خطر مانند ایالات متحده آمریکا، استرالیا و نیوزیلند[۳] و همچنین استفاده از کنستانتره‌های مغذی تمیز مشتق شده از سرم از محل کل سرم‌های حیوانی برای کشت سلولی است.[۴]

ترکیبات پایهٔ محیط کشت

ترکیبات عملکرد
منبع کربن (گلوکز / گلوتامین) منبع انرژی
آمینو اسید واحدهای سازندهٔ پروتئین‌ها
ویتامین‌ها تقویت بقا و رشد سلولی
محلول نمکی متعادل مخلوط ایزوتونیک از یون‌ها برای حفظ فشار اسمزی بهینه در سلول‌ها و تأمین یون‌های فلزی ضروری برای عمل به‌عنوان کوفاکتور برای واکنش‌های آنزیمی، چسبندگی سلولی و غیره.
رنگ فنل قرمز رنگ فنل قرمز، به‌عنوان شناساگر پی‌اچ دارای رنگ نارنجی/قرمز در پی‌اچ ۷–۷٫۴ است که به زرد در پی‌اچ اسیدی (پایین‌تر) و بنفش در پی‌اچ بازی (بالاتر) تغییر می‌کند.
بافر بی‌کربنات/HEPES برای حفظ پی‌اچ متعادل در محیط کشت، استفاده می‌شود.

یاخته‌ها از نظر نحوهٔ کشت یافتن در محیط کشت به دو دسته تقسیم می‌شوند: یاخته‌های وابسته به بستر (به انگلیسی: Anchorage dependent): این یاخته‌ها برای این‌که بتوانند تکثیر شوند، باید به سطحی متصل شده باشند. این یاخته‌ها بر روی محیط کشت به‌حدی تکثیر می‌شوند تا به‌صورت تک‌لایه، تمام سطح ظرف کشت را فرا گیرند. پس از آن به‌علت اثر فرایند ''ممانعت تماسی'' تکثیر یاخته‌ها، متوقف می‌شود. برخی از یاخته‌های تراریخته به‌علت این‌که پروتئین‌های سطحی خود (که در ممانعت تماسی نقش دارند) را از دست داده‌اند، می‌توانند به صورت چند لایه رشد کنند.

برای کشت یاخته‌های وابسته به بستر، به بسترهای خاصی نیاز است. شیشه به‌علت دارا بودن بار منفی بهترین سطح برای اتصال یاخته‌ها است. از سطوح پلاستیکی (دارای بار مثبت)، در صورتی‌که به کمک اشعه‌های یونیزه‌کننده، بارزدایی شوند نیز می‌توان استفاده کرد. یاخته‌ها به کمک پروتئین‌های سطحی خود مانند: اینتگرین‌ها، فیبرونکتین، کلاژن و لامینین به این سطوح متصل می‌شوند. یاخته‌های وابسته به بستر را همچنین می‌توان بر روی سطوح معلق کشت داد. برای این منظور گاهی از گلوله‌های کلاژن، پلی‌استایرن، سفادکس، ژلاتین یا پلی‌اکریل‌آمید، به‌عنوان سطحی برای اتصال یاخته‌ها استفاده می‌شود. این گلوله‌ها در محیط کشت مایع معلق می‌شوند.

برای این‌که یاخته‌ها بهتر به سطوح متصل شوند، می‌توان این سطوح را با کلاژن، فیبرونکتین، پرونکتین، انتاکتین، هپاران سولفات و.. پوشاند. همچنین می‌توان برای رشد اختصاصی یاخته‌ها از مواد خاصی استفاده کرد. برای مثال برای رشد اختصاصی کوندروسیت‌ها از کوندرونکتین استفاده می‌شود.

یاخته‌های غیروابسته به بستر (به انگلیسی: Anchorage Independent): این یاخته‌ها برای تکثیر و زنده ماندن لازم نیست قبلاً به سطحی متصل شده باشند. مانند سلول‌های بنیادی هپاتوسیتی یا رده‌های یاخته‌های تراریخته.

کاربردهای کشت سلول

کشت انبوهی از سلول‌های جانوری، اساس تولید واکسن‌های حیاتی و دیگر محصولات زیست‌فناوری هستند. کشت سلول‌های بنیادی به منظور افزایش تعداد سلول‌ها و تمایز آن‌ها به انواع مختلف سلول‌های سوماتیک برای پیوند انجام می‌شود.[۵]

همچنین از سلول‌های بنیادی، مولکول‌ها و اگزوزوم‌هایی آزاد می‌شوند که در درمان بیماری‌ها کاربرد دارند. استفاده از این مولکول‌ها و اگزوزوم‌ها یکی دیگر از اهداف کشت سلول‌های بنیادی است.[۶] آنزیم‌ها، هورمون‌های مصنوعی، زیست‌ایمن‌ها (آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، اینترلوکین‌ها و لنفوکین‌ها) و عوامل ضدسرطان، همگی از محصولات زیستی‌اند که به‌وسیلهٔ فناوری دی‌ان‌ای نوترکیب و با کشت سلول‌های جانوری به، دست آمده‌اند.

با این که بسیاری از پروتئین‌های ساده می‌توانند از طریق دی‌ان‌ای نوترکیب در کشت‌های باکتریایی تولید شوند، در حال حاضر بیشتر پروتئین‌های پیچیده که نیازمند گلیکوزیلاسیون هستند در سلول‌های جانوری ساخته می‌شوند. یک مثال مهم از چنین پروتئین‌های پیچیده‌ای اریتروپوئیتین است. هزینهٔ کشت سلول‌های جانوری، زیاد است بنابراین تحقیقات حاضر، به‌دنبال تولید چنین پروتئین‌های پیچیده‌ای در سلول‌های حشرات و گیاهان عالی هستند.

کشت سلولی همچنین یک تکنیک کلیدی برای کشاورزی سلولی است که هدف آن، ارائهٔ محصولات جدید و روش‌های جدید تولید محصولات کشاورزی و دامی موجود مانند شیر، گوشت درون‌کشتگاهی، عطرها و شاخ کرگدن از سلول‌ها و میکروارگانیسم‌ها است؛ بنابراین کشت سلول، یکی از ابزارهای دستیابی به کشاورزی بدون دام در نظر گرفته می‌شود. کشت سلول همچنین ابزاری مهم برای آموزش زیست‌شناسی سلولی است.[۷]

رده‌های سلولی معمول

انسان

جستارهای وابسته

منابع

  1. 1. "Some landmarks in the development of tissue and cell culture". Retrieved 2006-04-19.
  2. 2. ^ "Cell Culture". Retrieved 2006-04-19.
  3. 3. "Post - Blog | Boval BioSolutions, LLC". bovalco.com. Retrieved 2014-12-02.
  4. 4. "LipiMAX purified lipoprotein solution from bovine serum". Selborne Biological Services. 2006. Retrieved 2010-02-02.
  5. 5. Qiana L, Saltzman WM (2004) "Improving the expansion and neuronal differentiation of mesenchymal stem cells through culture surface modification." Biomaterials 25: 1331-1337.
  6. 6. Maguire G (2016) Therapeutics from Adult Stem Cells and the Hype Curve. ACS Med. Chem. Lett. 7 (5): 441–44
  7. Prieto D, Aparicio G, Sotelo-Silveira JR (November 2017). "Cell migration analysis: A low-cost laboratory experiment for cell and developmental biology courses using keratocytes from fish scales". Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (6): 475–482. doi:10.1002/bmb.21071. PMID 28627731.
  • Culture of Animal Cells. 3rd ed. R.Ian Frenshney 1994 ,Wiley-Liss

Read other articles:

Altkirchen Stadt Schmölln Wappen von Altkirchen Koordinaten: 50° 56′ N, 12° 21′ O50.93222222222212.346388888889228Koordinaten: 50° 55′ 56″ N, 12° 20′ 47″ O Höhe: 228 m ü. NHN Fläche: 20,07 km² Einwohner: 970 (31. Dez. 2018) Bevölkerungsdichte: 48 Einwohner/km² Eingemeindung: 1. Januar 2019 Postleitzahl: 04626 Vorwahl: 034491 Dorfkirche Altkirchen ist ein Ortsteil der Stadt Schmölln im th

 

Kurt von SchleicherKanselir Jerman ke-23Kanselir Republik Weimar ke-14Masa jabatan3 Desember 1932 – 28 Januari 1933PresidenPaul von HindenburgWakilLowongPendahuluFranz von PapenPenggantiAdolf HitlerPresiden Menteri Prusia(Reichskomissar)Masa jabatan3 Desember 1932 – 28 Januari 1933PendahuluFranz von PapenPenggantiFranz von PapenMenteri Petahanan ReichMasa jabatan1 Juni 1932 – 28 Januari 1933PresidenPaul von HindenburgKanselirFranz von Papen (1932)Diri sendiri ...

 

Amendemen Ketiga Puluh Empat Konstitusi IrlandiaLokasi IrlandiaTanggal22 Mei 2015 (2015-05-22) Hasil Suara % Ya 1.201.607 62,07% Tidak 734.300 37,93% Suara sah 1.935.907 99,29% Suara kosong atau tidak sah 13.818 0.71% Total suara 1,949,725 100.00% Pemilih terdaftar/hadir 3,221,681 60.52% Hasil menurut konstituensi Peta persebaran suara yang menyetujui amendemen:   72.5%–75%   70%–72.49%   67.5%–69.99%   65%–67.49%   62.5%–64.99%...

Random number generator based on atmospheric noise Random.orgRandom.org as of October, 2009Type of siteWeb serviceAvailable inEnglishOwnerMads HaahrCreated byMads HaahrURLwww.random.orgRegistrationoptionalLaunched1998Current statusonline Random.org (stylized as RANDOM.ORG) is a website that produces random numbers based on atmospheric noise.[1] In addition to generating random numbers in a specified range and subject to a specified probability distribution, which is the...

 

A May Kyay Zu Satt Phu Chin TalPoster filmNama lainBurmaအမေ့ကျေးဇူးဆပ်ဖူးချင်တယ် SutradaraKhin Saw Myo (A Phay Pyinnyar)ProduserDitulis olehMa Sandar (MIE MIE)SkenarioMa Sandar (MIE MIE)CeritaKhin Saing (Kyaung Kabar)Pemeran Pyay Ti Oo Thet Mon Myint Nay Aung May Than Nu Penata musikYee MonSinematograferNaing Nu SheinPerusahaanproduksiKyaung Kabar Film ProductionTanggal rilis2010Durasi114 menitNegara Myanmar Bahasa Myanmar A May Kyay...

 

此條目没有列出任何参考或来源。 (2021年12月6日)維基百科所有的內容都應該可供查證。请协助補充可靠来源以改善这篇条目。无法查证的內容可能會因為異議提出而被移除。 斐迪南·卡爾·約瑟夫 斐迪南·卡爾·約瑟夫(德語:Ferdinand Karl Joseph,1781年4月25日—1850年11月5日),奧地利斐迪南·卡爾大公的次子,母親是埃斯特的瑪麗亞·貝亞特麗切。 拿破崙戰爭期間,斐迪南率...

Caping Khas Baduy Lebak Banten Seorang pembeli sedang memilih caping yang dijual di daerah Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur, yang disebut seraung. Caping adalah sejenis topi berbentuk kerucut yang umumnya terbuat dari anyaman bambu. Caping ada juga yang terbuat dari daun pandan, atau sejenis rumputan,ataupun daun kelapa. Sebuah caping umumya dilengkapi dengan tali dagu yang berfungsi untuk menjaga keseimbangan caping. Selain bentuknya yang khas caping juga mempunyai kelebihan dibanding top...

 

Tennessee PassSummit of Tennessee Pass along U.S. Highway 24, showing the memorial to the 10th Mountain DivisionElevation10,424 ft (3,177 m)[1]Traversed by US 24Denver and Rio Grande Western RailroadLocationEagle / Lake counties, Colorado, U.S.RangeSawatch RangeCoordinates39°21′45″N 106°18′40″W / 39.36250°N 106.31111°W / 39.36250; -106.31111[1]Topo mapUSGS Leadville NorthTennessee PassLocation in Colorado Tennessee Pass elevation 10,424...

 

Airfields of the United States Army Air Forcein the Central Pacific Area  Part of World War IIDate1942–1945LocationCentral Pacific Area of World War IIResult Allied victory over the Empire of Japan (1945) Map all coordinates using: OpenStreetMap Download coordinates as: KML GPX (all coordinates) GPX (primary coordinates) GPX (secondary coordinates) During World War II, the United States Army Air Forces fought the Empire of Japan in the Central Pacific Area. As defined by the War D...

Geographical term in classical Greek literature for the upper Nile and areas south of the Sahara This article is about the Classical Greek term. For the modern country, see Ethiopia. For the genus of beetles, see Aethiopia (beetle). For the Billy Woods album, see Aethiopes (album). This article needs additional citations for verification. Please help improve this article by adding citations to reliable sources. Unsourced material may be challenged and removed.Find sources: Aethiopia ...

 

Maj (r) Azam Suleman KhanOmbudsman of PunjabIncumbentAssumed office July 2020Interior Secretary of PakistanIn officeApril 2020 – June 2020Appointed byImran KhanChief Secretary PunjabIn officeNovember 2019 – April 2020Appointed byImran KhanSucceeded byJawad Rafique Malik Personal detailsOccupationCivil servant, Pakistan Administrative Service Maj (r) Azam Suleman Khan (Urdu: میجر (ر) اعظم سلیمان خان) is a retired Pakistani civil servant who serves as...

 

Arterial road in Coimbatore, India Trichy RoadMaintained byNational Highways Authority of India Coimbatore City Municipal Corporation Length16.2 mi (26.1 km)west endCoimbatore Medical College, CoimbatoreMajorjunctionsState Bank Road/Big Bazar Street( Coimbatore Medical College Hospital ) Arts College Road/Sungam Lake Road(LIC Divisional Office)Nirmala College Road/Puliakulam Road/Sungam Bypass Road(Sungam Nanjundapuram Road/Puliakulam Road(Ramanathapuram) Sowripalayam Road/Thir...

1956 fighter aircraft family by Lockheed Badmash redirects here. For the webcomic, see Badmash.org. F-104 Starfighter Royal Netherlands Air Force F-104G Starfighter in flight, 1963 Role Air superiority fighter Fighter-bomber Type of aircraft National origin United States Manufacturer Lockheed First flight 4 March 1954 (XF-104)[1] Introduction 20 February 1958 (United States) Retired 1969 (USAF)1975 (US ANG) 1972 (Pakistan Air Force) 31 October 2004 (Italy) Status Retired from military...

 

Voce principale: Alberto Ascari. Alberto Ascari Le Risultati sportivi di Alberto Ascari comprendono i risultati, le statistiche ed i record del pilota motociclistico e automobilistico italiano Alberto Ascari. Indice 1 Formula Grand Prix 1.1 Risultati nei Gran Premi 1.2 Statistiche delle Grandi Prove 2 Formula 1 2.1 Statistiche del Campionato mondiale 2.2 Risultati nel Campionato mondiale 2.3 Risultati in gare extra Campionato 2.4 Record 2.5 Confronto con i compagni di squadra 3 Altre Formule ...

 

Buffalo Point First NationPeopleOjibwa or SaulteauxTreatyTreaty 3HeadquartersBuffalo Point, ManitobaLandMain reserveBuffalo Point 36Other reserve(s) Reed River 36A Buffalo Point IR 1 Buffalo Point IR 2 Buffalo Point IR 3 Agency 30 GovernmentChiefJohn ThunderCouncil Herman Green Drew Thunder Websitebuffalopoint-firstnation.ca Buffalo Point First Nation is an Ojibwa or Saulteaux First Nations located in the southeastern corner of Manitoba, along the shores of Lake of the Woods. It is bordered l...

1857–1949 personal anthem of the Pope Marcia trionfaleFormer national anthem of the Papal States and Vatican CityMusicVittorino Hallmayr, 1857Adopted1857 (Papal States)1929 (Vatican City State)Relinquished1870 (Papal States)1949 (Vatican City State)Succeeded byPontifical Anthem and MarchAudio sampleGran Marcia Trionfale (instrumental version)filehelp The Marcia trionfale (Italian for 'Triumphal March') was the first personal anthem of the Pope and the first state anthem of the Vatic...

 

Surgery of the jaw Orthognathic surgeryOsteotomies of the jaws: 1. LeFort I 2. Bilateral Sagittal Split 3. Genioplasty 4. IMDO 5. GenioPaully 6. Custom PEEK 7. SARME 8. Custom BIMAX 9. Super BIMAXICD-9-CM76.6[edit on Wikidata] Orthognathic surgery (/ˌɔːrθəɡˈnæθɪk/), also known as corrective jaw surgery or simply jaw surgery, is surgery designed to correct conditions of the jaw and lower face related to structure, growth, airway issues including sleep apnea, TMJ disorders, malocc...

 

German author and feature writer Monika Mann (first left) with her mother and siblings, 1919Monika Mann (7 June 1910 – 17 March 1992) was a German American author and feature writer. She was born in Munich, Germany, the fourth of six children of the Nobel Prize–winning author Thomas Mann and Katia, née Katharina Pringsheim. She trained as a pianist and her early attempts at a musical career seemed promising, but were not met with success and she instead pursued a career as a writer.[...

Đối với các định nghĩa khác, xem Rượu vang cam (định hướng). Rượu vang cam trước khi rõ ràng và ổn định Rượu vang cam, còn được gọi là rượu vang trắng có tiếp xúc với vỏ nho, rượu vang trắng lên men với vỏ nho, hoặc rượu vang màu hổ phách,[1], là một loại rượu vang được làm từ nho trắng, trong đó vỏ nho không được loại bỏ như trong quá trình sản xuất rượu vang trắng t...

 

Battle during the border conflict between Peru and Colombia Battle of La PedreraPart of the Colombian–Peruvian territorial disputePositions of the forces of Peru to the south and Colombia to the north of the Caquetá River, respectively, which functioned as a de facto border.Date10–12 July 1911LocationLa PedreraResult Peruvian victory:[1][2] Colombian troops retreat from La Pedrera Peruvian troops soon also abandon their position Peruvian dissatisfaction with the governmen...

 

Strategi Solo vs Squad di Free Fire: Cara Menang Mudah!