Kääbusmutandid

Kääbusmutandid (ρ- / rho-) on defektse hingamisahelaga mutandid, kelle fenotüübiks on metsiktüübist väiksemad kolooniad. Kääbusmutandid avastati pärmis S. cerevisiae. Aastal 1953 märkas Boris Ephrussi, et 1-2 koloonial 1000-st oli koloonia diameeter 1/3-1/2 metsiktüübi diameetrist.[1] Kääbusmutatsiooniga pärmi kolooniad on väikesed, kuna neis on blokeeritud hingamisahel, mis toodab efektiivsemalt ATP-d kui kääritamise rada. Seega ei ole petite pärmid võimelised kasutama kasvuks mittefermenteeritavaid süsinikuallikaid, näiteks glütserooli või etanooli. Külvates seega kääbusmutatsiooniga pärmi fermenteeritava süsinikuallikaga (nt glükoos) söötmele, tekivad väiksemad kolooniad kui metsiktüüpi pärmi külvates. Petite fenotüüpi tekitavad mutatsioonid mitokondriaalses genoomis, mitokondrite vähenemine või mutatsioonid nukleaarsetes geenides, mis mõjutavad mitokondri funktsiooni.[2] Kääbusmutante on leitud ka bakteritel.

Kääbusmutantide mitokondriaalne genoom koosneb fragmendist metsiktüübi mitokondriaalsest DNA-st (mtDNA-st), mida on amplifitseeritud. Fragmendi pikkus on ligikaudu 1% metsiktüübi genoomist ja kordub tandeemselt.[3]

Supressiivsus

Mitokondriaalne DNA pärandub pärmis metsiktüüpide omavahelisel ristamisel biparentaalselt erinevalt kõrgematest eukarüootidest[4]. Kääbusmutantide ristamisel metsiktüüpi pärmiga on võimalik määrata kääbusmutatsiooni tüüp, nimelt tsütoplasmaatiliste ehk mtDNA mutatsioonide kääbusmutantidega ristamisel esineb uniparentaalne pärandumine, aga nukleaarsete kääbusmutantide ristamisel biparentaalne. Need tsütoplasmaatilised kääbusmutandid, kelle mtDNA kantakse ristamisel metsiktüübiga järglastele edasi, nimetatakse supressiivseteks kääbusmutantideks ja need, kelle ristamisel metsiktüübiga kandub järglastele metsiktüübi mtDNA, nimetatakse neutraalseteks kääbusmutantideks.[5] Kääbusmutandi supressiivsus sõltub kääbusmutandi mtDNA korduvast fragmendist.[4]

Mitokondriaalse DNA pärandumine sõltub kääbusmutandi tüübist. Segregatsiooniliste kääbusmutantide ristamisel metsiktüübiga pärandub mtDNA vastavalt Mendeli seadustele. Neutraalsete mutantide ristamisel metsiktüübiga on järglaste mtDNA metsiktüüpi ja supressiivsete puhul pärandub järglastele petite mtDNA.

Rho0 kääbusmutantidel puudub mitokondriaalne DNA ja ristamisel metsiktüüpi pärmiga tekivad ainult metsiktüüpi kolooniad.

Ristates kääbusmutante, mis on põhjustatud tuuma geenide muutustest, tekivad järglased vastavalt Mendeli seadustele.[2]. Neid kääbusmutante nimetatakse segregatsioonilisteks mutantideks[6]. Hüpersupressiivse rho- ristamisel metsiktüübiga tekivad kõik rho- tüüpi kolooniad, sest seal on sagedamini ori piirkondi, mis konkureerivad replikatsooni masinavärgi pärast ja seega on soodustatud väiksema genoomiga mitokondrite säilitamine. Rho- ristamisel metsiktüübiga tekivad kõik metsiktüüpi kolooniad ainult juhul, kui enne meiootilist jagunemist toimub ka mitoos. Sellisel juhul suudetakse diploidis olev metsiktüüpi mitokondriaalne DNA ka replitseerida ning kääbusmutandi mtDNA degenereerub.[7] Hüpersupressiivsed kääbusmutandid tekitavad metsiktüübiga ristamisel üle 95% petite kolooniaid[3][8]. Hüpersupressiivsed omavad konserveerunud ori järjestust, milles asub promootor, või sellele sarnast oris järjestust. Hüpersupressiivsete mutantide ori järjestuste muutmisel kaovad neile iseloomulikud replikatsiooni intermediaadid ja uniparentaalne pärilikkus.[7]

Kääbusmutandid jagunevad seega neutraalseteks ja supressiivseteks ning viimased jagunevad omakorda supressiivseteks ja hüpersupressiivseteks.

  • Neutraalsed (rho0)
  • Supressiivsed (rho-)
    • Supressiivsed (mitteaktiivse ori-ga)
    • Hüpersupressiivsed (aktiivse ori-ga)

Mitokondriaalne genoom

Metsiktüüpi S. cerevisiae mitokondriaalses DNA-s on 8 erinevat ori järjestust[9]. Iga ori omab RNA polümeraasi promootorit ja 3 GC-boxi: A, B ja C box. Kuna ainult ori2, 3 ja 5 on leitud hüpersupressiivsetest kääbusmutantidest, siis nimetatakse neid aktiivseteks ori-deks ja teisi inaktiivseteks (neis on promootori ala katkestatud insertsioonidega).[8] Varem peeti ori järjestust replikatsiooni "originiks" ehk replikatsiooni initsiatsiooni järjestuseks ja arvati, et ori-de suurem tihedus hüpersupressiivsetel kääbusmutantidel tagab nende eelistatud replitseerimise metsiktüübiga ristamisel. Kuna aga mitmetel kääbusmutantidel pole ori järjestust, suutes samas säilitada mtDNA, siis ei saa neid pidada replikatsiooni "originideks" ja need pole vajalikud mtDNA replikatsiooniks.[10] Küll aga arvatakse, et ilma ori-ta rho- genoomis on ori-sarnased regioonid (oris), mida saab kasutada alternatiivse replikatsiooni initsiatsiooni signaalina.[11] Samuti pole replikatsiooniks vajalik ka aktiivsetelt ori-delt initsieeritav transkriptsioon ehk RNA praimerite olemasolu. Seda on tõestatud mitokondriaalse RNA polümeraasi deleteerimisega. Küll aga on transkriptsiooni vaja hüpersupressiivsuseks.[7]

Teke

Üheks hüpoteesiks kääbusmutantide tekkemehhanismi kohta on väljalõike ja amplifitseerimise teooria. Väljalõiget amplifitseeritakse tandeemselt ja sellest saab 'kääbusmutandi defektse genoomi ühik.[11]

Ade-mutantide petite kolooniad, indutseeritud etiidiumbromiidiga

Kääbusmutandid tekivad ka juhuslikult – ilma mutageneesita (1-2 kolooniat 1000st[1]), kuid tihti võib olla tegemist nukleaarse kääbusmutandiga. Seepärast kasutatakse teadustöödes kääbusmutantide tekitamiseks mutageene, mis mõjutavad peamiselt mitokondriaalset DNAd. Kääbusmutatsiooni võib tekitada erinevate mutageenide toimel, näiteks DNA-ga interkaleeruvad ained (etiidiumbromiid) või kemikaalid, mis segavad DNA sünteesi kasvavates rakkudes. Paljud kemikaalid, mis põhjustavad raskesti parandatavaid DNA kahjustusi, tekitavad kääbusmutatsiooni ja on pigem efektiivsemad mittekasvavates rakkudes. Olenevalt mutageeni võimest transporteeruda mitokondrisse ja tema afiinsusest AT-aluspaaridele sõltub, kas mutageen mõjutab mitokondris või tuumas kodeeritud geene.[12] Näiteks saab kasutada hüdrofoobseid interaktsioone]takistavaid kemikaale nagu etanool, isopropanool või naatriumdodetsüülsulfaat ehk SDS.[13] Analoogiad pärmi ja imetajate mitokondrite vahel viitavad pärmi kääbusmutatsiooni põhjustavate mutageenide potentsiaalsele kartsinogeensele toimele.[12]

Tuvastamine

Kääbusmutantide tuvastamiseks kasutatakse tihti ade-mutante. Need pärmi mutandid ei suuda sünteesida adeniini ja peavad kasvama adeniini sisaldaval söötmel. Mutantide adeniini sünteesirajas akumuleerub aine, millest tekib punane pigment. Rho- tüved kasutavad energia saamiseks ainult kääritamisrada ja oksüdatiivse metabolismi puudumise tõttu ei teki punast pigmenti, mistõttu kolooniad jäävad valgeks.[14]

Viited

  1. ↑ 1,0 1,1 Ephrussi B. 1953. Nucleo-cytoplasmic relations in micro-organisms: their bearing on cell heredity and differentiation
  2. ↑ 2,0 2,1 Day M. 2013. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season
  3. ↑ 3,0 3,1 Blanc H. and Dujon,B. 1980 Replicator regions of the yeast mitochondrial DNA responsible for suppressiveness
  4. ↑ 4,0 4,1 Dujon B. 1981 Mitochondrial genetics and functions. In Strathern,J.N., Jones,E.W. and Broach,J.R. (eds), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 505–635.
  5. ↑ Ephrussi B., Grandchamp S. 1965 Etudes sur la suppressivité des mutants à deficience respiratoire de la levure. I. Existence au niveau cellulaire de divers degrés de suppressivité. Heredity, 20, 1–7
  6. ↑ H. Heslot, C. Louis and A. Goffeau 1970 Segregational Respiratory-Deficient Mutants of a "Petite Negative" Yeast Schizosaccharomyces pombe 972h−
  7. ↑ 7,0 7,1 7,2 David M. MacAlpine et al. 2001 Replication and preferential inheritance of hypersuppressive petite mitochondrial DNA
  8. ↑ 8,0 8,1 de Zamaroczy M., Marotta,R., Faugeron-Fonty,G., Goursot,R., Mangin,M., Baldacci,G. and Bernardi,G. 1981 The origins of replication of the yeast mitochondrial genome and the phenomenon of suppressivity. Nature, 292, 75–78
  9. ↑ de Zamaroczy M., Faugeron-Fonty G. et al. 1984The ori sequences of the mitochondrial genome of a wild-type yeast strain: number, location, orientation and structure. Gene, 32, 439–457
  10. ↑ Fangman et al., 1989 Stable maintenance of a 35-base pair yeast mitochondrial genome Mol. Cell. Biol., 9, 1917–1921
  11. ↑ 11,0 11,1 G. Bernardi 2005 Lessons from a small, dispensable genome: The mitochondrial genome of yeast Gene 354, 189 – 200
  12. ↑ 12,0 12,1 Ferguson, L.R., and von Borstel, R. C. 1992 Induction of the cytoplasmic 'petite' mutation by chemical and physical agents in Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research 265:103-48
  13. ↑ Jimenez J. et al. 1988 Induction of petite yeast mutants by membrane-active agents.
  14. ↑ Ugolini S. 1996The red/white colony color assay in the yeast Saccharomyces cerevisiae: epistatic growth advantage of white ade8-18, ade2 cells over red ade2 cells.Curr Genet. 1996 Dec;30(6):485-92.

Strategi Solo vs Squad di Free Fire: Cara Menang Mudah!