Mai Zetterling kam aus einfachen Verhältnissen und wurde bereits mit 17 Jahren von der Königlichen Schauspielschule für dramatisches Theater Dramatens elevskola, der Ausbildungsstätte des Königlichen Dramatischen Theaters in Stockholm angenommen. Noch während des Studiums (1942–1945) erhielt sie erste Rollen und war bis 1947 Ensemblemitglied. Danach hatte sie ein Engagement in London und spielte in Bühnenstücken von Anouilh, Tschechow und Ibsen.
Ihr Filmdebüt hatte sie bereits 1941 als 16-Jährige in einem Film von Gunnar Olsson. Mit ihrer Darstellung des Opfers eines sadistischen Professors in Die Hörige (1944) von Alf Sjöberg wurde sie international bekannt. Das Drehbuch zu diesem Film schrieb Ingmar Bergman. Ab 1950 trat sie neben der Arbeit am Theater überwiegend in britischen Spielfilmen auf.
Von 1944 bis 1953 war sie mit dem Schauspieler und Tänzer Tutte Lemkow verheiratet. Aus der Ehe gingen Sohn und Tochter hervor. 1959 heiratete sie den Drehbuchautor David Hughes.
1960 hatte Mai Zetterling ihr Debüt als Regisseurin. Sie arbeitete für die BBC und drehte Kurz- und Dokumentarfilme über den Umgang mit ethnischen Minderheiten, Frauendiskriminierung und Probleme der Heranwachsenden. Für ihren Kurzfilm The War Game (1963) erhielt sie eine Auszeichnung auf dem Filmfestival von Venedig. Ab 1964 schrieb sie mit ihrem Mann auch in Schweden Drehbücher und führte Regie. Ihre Filme provozieren mit den Themen Einsamkeit und sexuelle Obsessionen. Die Literaturverfilmung Liebende Paare (1964) wurde in Cannes abgelehnt und Verschwiegene Spiele (1966) wurde vom Wettbewerb in Venedig wegen seiner drastischen Szenen ausgeschlossen. Für Die Mädchen war das Publikum dann reif.
Seit Mitte der 1960er Jahre veröffentlichte Mai Zetterling mehrere Romane.
Nachdem sie im Dokumentarfilm Frauen führen Regie (1988) porträtiert wurde, stand Zetterling für Nicolas RoegsThe Witches (1990) erst- und letztmals seit Mitte der 1960er Jahre wieder als Darstellerin vor der Kamera.
