Hampden gehörte einer Familie der englischen Gentry an. Er war der älteste Sohn und Erbe von William Hampden († 1570), Gutsherr von Hampden House in Great Hampden, Buckinghamshire, und Elizabeth Cromwell († 1664), der zweiten Tochter von Sir Henry Cromwell († 1604) und Tante von Oliver Cromwell. Er studierte an der University of Oxford.
Im Jahre 1636 weigerte sich John Hampden, später einer der bedeutendsten Führer der englischen bürgerlichen Revolution, dem königlichen Steuereintreiber das „Schiffsgeld“ zu zahlen – eine Steuer, die vom Unterhaus nicht bestätigt worden war.[1] Der darauffolgende Prozess vor dem obersten Gerichtshof, in dem er verurteilt wurde, trug ihm große Popularität ein und führte zum Anwachsen der bürgerlichen Opposition gegen den Absolutismus.
1640 trat er im Parlament an die Spitze der Opposition und gehörte zu den fünf Mitgliedern des Unterhauses, welche 1642 vor dem Oberhaus des Hochverrats angeklagt wurden. Im Englischen Bürgerkrieg (1642–1649) war Buckinghamshire überwiegend parlamentarisch eingestellt. John Hampden half in der Schlacht von 1642 mit, Aylesbury zu verteidigen und wurde bei Chalgrovefield, einige Meilen von Oxford, in einem Reitertreffen am 18. Juni 1643 verwundet und starb sechs Tage später in Thame, Oxfordshire.
