Eisele war zuerst Testpilot und bekam 1952 den Bachelor- und 1960 den Mastertitel und wurde mit der dritten Gruppe von Astronauten 1963 von der NASA ausgewählt. Am 11. Oktober 1968 startete er zusammen mit Walter Schirra und Walter Cunningham mit einer Saturn-1B-Rakete ins All. Eisele war Pilot der Mission, die das Ziel hatte, das Apollo-Raumschiff im Weltall zu testen. Nach 260 Stunden und 46 Minuten Flug landete Apollo 7 am 22. Oktober sicher im Atlantik. Er war noch in der Ersatzmannschaft von Apollo 10, bevor er 1972 die NASA verließ.
Am 2. Dezember 1987 starb Eisele an einem Herzinfarkt, als er sich zu einer Geschäftsreise in Japan aufhielt. Er hinterließ seine Frau Susan und ihre zwei gemeinsamen Kinder sowie vier Kinder aus einer früheren Ehe.