Chimerní antigenní receptor

Arteficiální T buněčné receptory (známé také jako chimerní T buněčné receptory, dimerní T receptory, chimerní antigenní receptory - CARs) jsou receptory, které jsou navrženy tak, aby přenesly libovolnou antigenní specifičnost na imunní efektorovou buňku. Tyto receptory jsou užity k přenosu specificity monoklonální protilátky na T buňku, s přenosem jeho kódovací sekvence napomáhá retrovirový vektor. Tímto způsobem můžeme vytvořit velký počet nádorově specifických T buněk.^[1] Již během první fáze klinických studií CARs se ukázala účinnost těchto přístupů.

Anatomie CARů

Nejčastější formou těchto molekul jsou splynuté jednoduché řetězce variabilních fragmentů (scFV), odvozených od monoklonálních protilátek, připojené k CD3-zeta transmembránové části a endodoméně. Tyto molekuly přenášejí signál zeta, jako odpověď na rozpoznání cílové molekuly pomocí scFV. Příkladem takového konstruktu je 14g2a-Zeta, kde jsou připojeny scFV odvozené od hybridomu 14g2a (který rozpoznává disialogangliosid GD2). Když T buňky exprimují tuto molekulu (obvykle v důsledku transdukce onkoretrovirovým vektorem) rozpoznává a zabijí cílovou buňku, která exprimuje GD2 (např. neuroblastomové buňky). K zacílení maligních B buněk je využíváno CAR-modifikovaných T buněk, které rozpoznávají specifické molekuly pro B buněčné linie, např. CD 19.

Obrázek ukazuje rozdílné části arteficiálního TCR

Variabilní části na těžkém a lehkém řetězci imunologlobinu jsou spojeny pomocí flexibilního linkeru do formy scFV. scFV má k sobě připojen signální peptid k řízení vznikajícího peptidu do endoplazmatického retikula a jeho následné expresi (je štěpen). Flexibilní spacer umožňuje scFV orientovat se v různých směrech, což umožňuje vazbu k antigenu. Transmembránová doména je typicky hydrofobní alfa-helix struktura, odvozena z původní molekuly signální endodomény, která vyčnívá do buňky a přenáší požadovaný signál.

Skutečnost, že tyto molekuly skutečně fungují, je na první pohled překvapující. Na druhý pohled si uvědomíme, že bílkovina typu I jsou de facto dvě bílkovinné domény spojeny transmembránovým alfa-helixem. Lipidovou dvouvrstvou prochází transmembránová doména, která od sebe izoluje vnější část (ektodoména, z ang.: ectodomain) od vnější části (endodoména, z ang.: endodomain). Není tedy už překvapením, že propojením ektodomény z jednoho proteinu k endodoméně druhého proteinu vznikne molekula, která je schopna rozpoznat svůj cíl a následně přenést signál do buňky.

Pro lepší pochopení dané problematiky, budou jednotlivé složky tohoto systému probrány jednotlivě:

Ektodoména – signální peptid

Signální peptid řídí vznikající protein v endoplasmatickém retikulu. Je to důležité, jestliže má být receptor glykosilovaný a ukotvený v buněčné membráně. Eukaryotické signální peptidy obvykle dobře fungují. Obecně platí, že ve většině případů je signální peptid přirozeně připojen k NH2 konci (např. u scFV se orientuje: lehký řetězec – linker – těžký řetězec).

Ektodoména – rozpoznání

Jako antigen rozpoznávající doména slouží obvykle scFV, ale existuje však mnoho alternativ. Například u nativního TCR alfa a beta řetězce byla antigen rozpoznávací doména popsána jako jednoduchá ektodoména (např. CD 4 ektodoména k rozpoznání buňky nakažené HIV), ale bylo též popsáno mnoho dalších, více exotických rozpoznávajících komponentů, jako je např. navázaný cytokin (které rozpoznávají buňky, které nesou receptor pro daný cytokin). Jako antigen rozponávající region můžeme použít cokoli, co váže cílovou molekulu s dostatečnou afinitou.

Ektodoména – spacer

Spacer váže antigen-vázající doménu k transmembránové doméně. Měla by být dostatečně flexibilní, aby zaručila, že se antigen-vazebná doména může orientovat v různých směrech a tím usnadnit rozpoznání antigenu. Nejjednodušší formou je tzv. hinge region z IgG1. Alternativou je CH₂CH₃ region z imunoglobulinu, nebo části z molekuly CD3. Pro většinu scFV konstruktů je tzv. hinge region z molekuly IgG1 dostatečný. Nicméně nejlepší spacer musí být stanoven empiricky.

Transmembránová doména

jedná se o hydrofobní alfa-helix, který prochází buněčnou membránou. Obecně se používají transmembránové domény z nejproximálnějších membránových částí endodomén. Zajímavé je, že užití CD3-zeta transmembránové domény má za následek inkorporaci artificiálního TCR do nativního TCR, faktoru, který je dependentní na přítomnosti nabitého zbytku kyseliny aspartamové transmembránového nativního CD3-zeta.^[2] Rozdílné transmembránové domény mají za následek rozdílnou receptorovou stabilitu. CD28 transmembránová doména má za následek jasnou expresi a stabilní receptor.

Endodoména

Jedná se o koncovou část. Po rozpoznání antigenu se receptory shlukují a přenášejí signál do vnitra buňky. Nejčastěji používanou endodoménou je CD3-zeta, která obsahuje tři molekuly ITAM. Slouží jako přenašeč signálu T buňkám po navázání antigenu. CD3-zeta však nemusí vždy poskytovat zcela dostačující signál k aktivaci, a je nutné přidat ještě další kostimulační signály. Například je možné použít chimerní CD28 nebo OX40 společně s CD3-zeta k přenosu signálu k proliferaci, či k přežití buňky. V některých případech lze kombinovat všechny tři molekuly dohromady.

Evoluce v projektování T buněčných CARů

Porovnání první, druhé a třetí generace Chimerního antigenního receptoru s scFV segmenty v zeleném a rozdílné TCR signální komponenty v červeném, modrém a žlutém označení.^[3]

První generace CARů zpravidla měla intracelulární doménu z CD3ξ řetězce, který sloužil jako primární vysílač signálů z endogenních TCR. U Druhé generace CARů byly přidány do cytoplazmatických částí CARů intracelulární signální domény z různých kostimulačních receptorů (např. CD28, 41BB, ICOS), které poskytovali další signály T buňkám. V případě Druhé generace CARů, předklinické studie poukázaly na to, že dochází u T buněk k posílení protinádorové imunity. Novější Třetí generace CARů již kombinuje různé signalizační domény, jako je CD3-zeta – CD28 – 41BB nebo CD3-zeta – CD28 – OX40.

Klinické studie testující Chimérní antigenní receptory

Tato metoda je založena na reprogramování T buněk vektorem (např. virovým). Buňky následně exprimují chimerické antigenní receptory, které jsou cíleny proti nádorovým buňkám a jejím rozeznáním umožňují jejich následné zničení. Díky tomuto poznatku, se CARs-modifikované T buňky staly středem zájmu vědců z celého světa, kteří se v pre-klinické fázi zajímají o jejich optimalizaci v oblasti struktury a signalizace. V současné době již probíhají klinické studie, které naznačují jisté budoucí využití této metody v léčbě maligních stavů.

První generace CARs-modifikovaných T buněk zaznamenala úspěch během preklinických testů a následně vstoupila do první fáze klinických studií. CARs-modifikované T buňky byly cíleny na ovariální karcinom, neuroblastom a různé typy leukemií a lymfomů (viz tab.). Klinické studie neprokázaly významný klinický přínos a upozornily na nedostatečnou anti-nádorovou aktivitu, poruchu aktivace, nedostatečnou perzistenci a homing do místa nádoru. Jen v několika případech u pacientů s B-lymfomem (léčených αCD20-CD3ζ CAR-modifikovanými T-buňkami) a neuroblastomem (léčených ScFv-CD3ζ CAR-modifikovanými T buňkami), byla pozorována částečná odpověď - stabilizace stavu, nebo došlo k remisi onemocnění. Druhá a třetí generace CARs-modifikovaných T buněk vedla ke zlepšení aktivačního signálu, zvýšení proliferace, zvýšení produkce cytokinů a celkovému zlepšení efektorových funkcí CAR-modifikovaných T buněk v pre-klinických modelech. Obě dvě tyto generace CARs-modifikovaných T buněk vstoupily do klinických testů. Již první klinické testy naznačují velmi slibné výsledky. Ve studii s αCD19.4-1BB-CD3ζ T buněk u pacientů s chronickou lymfatickou leukemií došlo ke kompletní remisi a u jednoho pacienta k dílčí reakci, která probíhala 10 měsíců po léčbě. Navíc bylo nalezeno zvýšení CAR-modifikovaných buněk o tři řády, které infiltrovali a lyzovali nádorovou tkáň. Zajímavostí je, že některé CARs-modifikované T buňky vykazovaly fenotyp paměťových buněk, což může sloužit jako prevence relapsů onemocnění. Ačkoli tyto modifikované T buňky vykazovaly výrazný terapeutický efekt, jejich cytotoxická činnost vedla k nebezpečnému syndromu z lýzy nádoru, který se vyvinul 3 týdny po podání první infuze CARs-modifikovaných T buněk.

Nedávno zveřejněné vedlejší účinky poukazují na fakt, jak je důležité dbát na opatrnost, při použití CARs-modifikovaných T buněk druhé a třetí generace. Pacient zemřel 5 dnů po cyklofosfamidové chemoterapii, která zahrnovala infuzi modifikovaných T buněk, obsahující část z CD28. Toxicita vedla k nárůstu prozánětlivých cytokinů, plicní toxicitu, multiorgánové selhání a eventuální smrt pacienta. Dalším problémem je tzv. off target cytotoxicita, která vede k autoimunním reakcím, kvůli tomu, že většina tumor-asociovaných antigenů se vyskytuje i na normální tkáni.

Velkým slibem do budoucna je imunoterapie rakoviny, bez toxicity konvenční léčby. Podle pre-klinický a klinických studií CAR-modifikované buňky dávají naději. Léčba touto metodou má několik výhod: rozpoznání cíle nezávislé na HLA antigenech, použitelnost pro většinu pacientů a rychlé dodání buněk. Pro úspěšnou aplikaci těchto buněk bude však nutné identifikovat cílové antigeny vyjádřené na nádorových buňkách, čímž se značně sníží riziko cytotoxicity.^[4],^[5]

Aktuální seznam tumorových antigenů a CARs uplatněných v in-vitro a in-vivo trudiích ^[6],^[7]:

Cílový antigen	Související malignita	Typ receptoru	CARs generace
α-Folátový receptor	Nádor vaječníků	ScFv-FcεRIγCAIX	První
CAIX	Karcinom renálních buněk	ScFv-FcεRIγ	První
CAIX	Karcinom renálních buněk	ScFv-FcεRIγ	Druhá
CD19	B-buněčné malignity	ScFv-CD3ζ (EBV)	První
CD19	B-buněčné malignity, CLL	ScFv-CD3ζ	První
CD19	B-ALL	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	ALL	CD3ζ(EBV)	První
CD19	ALL post-HSCT	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	Leukemie, lymfom, CLL	ScFv-CD28-CD3ζ vs. CD3ζ	První and Druhá
CD19	B-buněčné malignity	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	B-buněčné malignity post-HSCT	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	Refractorní folikulární lymfom	ScFv-CD3ζ	První
CD19	B-NHL	ScFv -CD3ζ	První
CD19	B-liniová lymfoidní malignity post-UCBT	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	CLL, B-NHL	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	B buněčné malignity, CLL, B-NHL	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD19	ALL, lymfom	ScFv-41BB-CD3ζ vs CD3ζ	První and Druhá
CD19	ALL	ScFv-41BB-CD3ζ	Druhá
CD19	B-buněčné malignity	ScFv-CD3ζ (Influenza MP-1)	První
CD19	B-buněčné malignity	ScFv-CD3ζ (VZV)	První
CD20	Lymfomy	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD20	B-buněčné malignity	ScFv-CD4-CD3ζ	Druhá
CD20	B-buněčné lymfomy	ScFv-CD3ζ	První
CD20	Mantle cell lymfom	ScFv-CD3ζ	První
CD20	Mantle cell lymfom, indolent B-NHL	CD3 ζ /CD137/CD28	Třetí
CD20	indolent B-cell lymphomas	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD20	Indolentní B-buněčný lymfomy	ScFv-CD28-41BB-CD3ζ	Třetí
CD22	B-buněčné malignity	ScFV-CD4-CD3ζ	Druhá
CD30	Lymfomy	ScFv-FcεRIγ	První
CD30	Hodgkinův lymfom	ScFv-CD3ζ (EBV)	První
CD33	AML	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CD33	AML	ScFv-41BB-CD3ζ	Druhá
CD44v7/8	Cervikální karcinom	ScFv-CD8-CD3ζ	Druhá
CEA	Breast cancer	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CEA	Kolorektální karcinom	ScFv-CD3ζ	První
CEA	Kolorektální karcinom	ScFv-FceRIγ	První
CEA	Kolorektální karcinom	ScFv-CD3ζ	První
CEA	Kolorektální karcinom	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
CEA	Kolorektální karcinom	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
EGP-2	Mnohočetné malignity	scFv-CD3ζ	První
EGP-2	Mnohočetné malignity	scFv-FcεRIγ	První
EGP-40	Kolorektální karcinom	scFv-FcεRIγ	První
erb-B2	Kolorektální karcinom	CD28/4-1BB-CD3ζ	Třetí
erb-B2	Karcinom prsu	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
erb-B2	Karcinom prsu	ScFv-CD28-CD3ζ (Influenza)	Druhá
erb-B2	Karcinom prsu	ScFv-CD28mut-CD3ζ	Druhá
erb-B2	Nádor prostaty	ScFv-FcεRIγ	První
erb-B 2,3,4	Karcinom prsu	Heregulin-CD3ζ	Druhá
erb-B 2,3,4	Karcinom prsu	ScFv-CD3ζ	První
FBP	Nádor vaječníků	ScFv-FcεRIγ	První
FBP	Nádor vaječníků	ScFv-FcεRIγ (alloantigen)	První
Fetalní acethylcholinový receptor	Rhabdomyosarkom	ScFv-CD3ζ	První
GD2	Neuroblastom	ScFv-CD28	První
GD2	Neuroblastom	ScFv-CD3ζ	První
GD2	Neuroblastom	ScFv-CD3ζ	První
GD2	Neuroblastom	ScFv-CD28-OX40-CD3ζ	Third
GD2	Neuroblastom	ScFv-CD3ζ (VZV)	První
GD3	Melanom	ScFv-CD3ξ	První
GD3	Melanom	ScFv-CD3ξ	První
Her2/neu	Medulloblastom	ScFv-CD3ξ	První
Her2/neu	Plicní malignity	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
Her2/neu	Pokročilý osteosarkom	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
Her2/neu	Glioblastom	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
IL-13R-a2	Gliom	IL-13-CD28-4-1BB-CD3ζ	Třetí
IL-13R-a2	Glioblastom	IL-13-CD3ζ	Druhá
IL-13R-a2	Medulloblastom	IL-13-CD3ζ	Druhá
KDR	Vaskulární tumory	ScFv-FcεRIγ	First
k-light chain	B-buněčné malignity	ScFv-CD3ζ	První
k-light chain	(B-NHL, CLL)	ScFv-CD28-CD3ζ vs CD3ζ	Druhá
LeY	Karcinomy	ScFv-FcεRIγ	První
LeY	Epiteliální tumory	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
L1 cell adhesion molecule	Neuroblastom	ScFv-CD3ζ	First
MAGE-A1	Melanom	ScFV-CD4-FcεRIγ	Druhá
MAGE-A1	Melanom	ScFV-CD28-FcεRIγ	Druhá
Murine CMV infected cells	Murine CMV	Ly49H-CD3ζ	Druhá
MUC1	Nádory prsu a vaječníků	ScFV-CD28-OX40-CD3ζ	Třetí
NKG2D ligands	Různé tumory	NKG2D-CD3ζ	First
Oncofetal antigen (h5T4)	Různé tumory	ScFV-CD3ζ (vaccination)	První
PSCA	Prostate carcinoma	ScFv-b2c-CD3ζ	Druhá
PSMA	Prostatické a cévní tumory	ScFv-CD3ζ	První
PSMA	Prostatické a cévní tumory	ScFv-CD28-CD3ζ	Druhá
PSMA	Prostatické a cévní tumory	ScFv-CD3ζ	První
TAA targeted by mAb IgE	Různé tumory	FceRI-CD28-CD3ζ (+ a-TAA IgE mAb)	Třetí
TAG-72	Adenocarcinom	scFv-CD3ζ	První
VEGF-R2	Vaskulární tumory	scFv-CD3ζ	První

Zlepšení bezpečnosti adoptivního přenosu CAR-modifikovaných buněk jako terapie rakoviny

Popis metody přenosu modifikovaných buněk pomocí adoptivního přenosu.

Adoptivní přenos buněk, které exprimují chimerní antigenní receptory, jsou považovány za slibné protirakovinné terapeutikum. CAR-modifikované buňky mohou být navrženy tak, aby byly cíleny proti některým tumor-asociovaných antigenům a díky tomu mohou být specificky cíleny individuálně pro každého pacienta. Díky tomu se jedná se o slibnou terapeutickou metodu léčby rakoviny.

Poté, co jsou pacientovi odebrány T-buňky, jsou geneticky upraveny k expresi CARů, konkrétně zaměřených proti pacientovým nádorovým antigenům. Následně jsou připraveny k infúzi zpět do těla pacienta.^[8] Ačkoli adoptivní přenos CAR-modifikovaných buněk je jedinečným a perspektivním léčebným prostředkem rakoviny, existují významné obavy o bezpečnost této metody. Klinické studie této terapie ukázaly potenciální toxické účinky CARů, když zdravé tkáně exprimují stejné cílové antigeny jako jsou obsaženy v nádorových buňkách, což vede ke stavům podobným graft-versus-host disease(GvHD). Potenciálním řešením tohoto problému je sestrojení sebevražedného genu, který by byl vložen do modifikovaných T-buněk. Touto cestou by došlo ke spuštění sebevražedných genů v aktivovaných CAR-modifikovaných T-buněk. Tato metoda byla již bezpečně a efektivně při transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT). V současné době jsou sebevražedné geny podrobeny klinickým testum, pro svůj potenciál zmírnění těchto vedlejších účinků při současném zvýšení protinádorových účinků.^[3]

Odkazy

Reference

V tomto článku byl použit překlad textu z článku Chimeric antigen receptor na anglické Wikipedii.

1. PULE, M, Finney H, Lawson A. Artificial T-cell receptors. Cytotherapy. 2003, s. 211–26. DOI 10.1080/14653240310001488. PMID 12850789. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
2. BRIDGEMAN, JS, Hawkins RE, Bagley S, Blaylock M, Holland M, Gilham DE. The Optimal Antigen Response of Chimeric Antigen Receptors Harbouring the CD3zeta Transmembrane Domain Is Dependent Upon Incorporation of the Receptor Into the Endogenous TCR/CD3 Complex. Journal of Immunology. 2010, s. 6938–49. DOI 10.4049/jimmunol.0901766. PMID 20483753. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
3. CASUCCI, Monica, Attilio Bondanza. Suicide Gene Therapy to Increase the Safety of Chimeric Antigen Receptor-Redirected T Lymphocytes. Journal of Cancer. 2011, s. 378-382. Dostupné online [cit. 30 April 2012]. PMID 21750689. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
4. CURRAN, Kevin J., Pengram Hollie J, Brentjens Renier J. The promise and potential. J Gene Med. 2012, s. 405–415. Dostupné online [cit. 5 January 2012]. DOI 10.1002/jgm.2604. PMID 22262649. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
5. LIPOVSKA-BHALLA, Grazyna, Gilham David E., Hawkins Robert E., Rothwell Dominic G. Target immunotherapy of cancer with CAR T cell: achievements and challenges. Cancer Immunol Immunother. 2012, s. 953–962. Dostupné online [cit. 25 March 2012]. DOI 10.1007/s00262-012-1254-0. PMID 22527245. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.^{[nedostupný zdroj]}
6. LIPOWSKA-BHALLA, Grazina, Gilham David E., Hawkins Robert E., Rothwell Dominic G. Target immunotherapy of cancer with CAR T cell: achievements and challenges. Cancer Immunol Immunother. 2012, s. 953–962. Dostupné online [cit. 25 March 2012]. DOI 10.1007/s00262-012-1254-0. PMID 22527245. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.^{[nedostupný zdroj]}
7. SADELAIN, M., Gilham David E., Hawkins Robert E., Rothwell Dominic G. The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptor. Curr Opin Immunol. 2009, s. 215–223. Dostupné online [cit. April 2009]. DOI 10.1016/j.bbr.2011.03.031. PMID 19327974. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“.
8. JACOBSON, Caron, Jerome Ritz. Time to put the CAR-T before the horse. Blood. 3, s. 4761-4762. Dostupné online [cit. 7 May 2012]. DOI 10.1182/blood-2011-09-376137. PMID 22053170. Je zde použita šablona {{Cite journal}} označená jako k „pouze dočasnému použití“. Archivovaná kopie. bloodjournal.hematologylibrary.org [online]. [cit. 2012-09-12]. Dostupné v archivu pořízeném z originálu. 

Externí odkazy

• (anglicky) Historie chimerních antigenních receptorů