Od roku 1550 působil v Římě, kde ve spolupráci s Vasarim a Vignolou navrhl mnoho budov, kromě jiných spolupracoval i na výstavbě paláce Villa Giulia, letního sídla papeže Julia II. (V současnosti Národní muzeum). Stavba, do které papež investoval velké množství finančních prostředků, je jedním z nejlepších příkladů manýristické architektury.
Je i autorem nádherného florentského mostu Ponte Santa Trinita přes řeku Arno, který je vedle florentského mostu Ponte Vecchio nejstarším elipsovým obloukovým mostem na světě.
Patřil k nejvyhledávanějším sochařům ve Florencii, o čemž svědčí i významná zakázka na Neptunovu fontánu na Piazza della Signoria, kde dostal přednost před takovými mistry své doby jako byly Benvenuto Cellini a Giambologna.
Ammanatiho sochy byly tvořeny částečně v barokním stylu, ale především se při jejich stvárňovaní řídil manýristickými principy. Ve své sochařské tvorbě se často inspiroval Michelangelem, jakož i svým mistrem Sansovinem.
Byl velkým mistrem aktů, ale na konci svého života ovlivněn protireformací, své akty zavrhl.
