Utišavanje gena

Mehanizam posttranslacijskog utišavanja gena kod sisara

Utišavanje gena je regulacija ekspresije gena u ćeliji, kako bi se spriječila ekspresija određenog gena.^[1][2] Utišavanje gena može se dogoditi ili tokom transkripcije ili translacije i često se koristi u istraživanju.^[1][2] Posebno, metodi koji se koriste za utišavanje gena se sve više koriste za proizvodnju terapeutika za borbu protiv raka i drugih bolesti, kao što su infektivne bolesti i neurodegenerativni poremećaji.

Utišavanje gena se često smatra isto što i genski nokdaun.^[3][4] Kada se geni utišaju, njihova ekspresija je smanjena.^[3][4] Nasuprot tome, kada su geni nokautirani, oni se potpuno brišu iz genom aorganizma i, stoga, nemaju ekspresiju.^[3][4] Utišavanje gena se smatra obaranjem funcije gena jer metodi koji se koriste za utišavanje gena, kao što su RNKi, CRISPR ili siRNK, općenito smanjuju ekspresije gena za najmanje 70%, ali je ne eliminišu. Metodi koji koriste utišavanje gena često se smatraju boljim od nokauta gena jer omogućavaju istraživačima da proučavaju bitne gene koji su potrebni da životinjski modeli prežive i ne mogu se ukloniti. Osim toga, oni pružaju potpuniji pogled na razvoj bolesti jer su bolesti općenito povezane s genima koji imaju smanjenu ekspresiju.

Tipovi

Transkripcija

• Genomski otisak
• Paramutacija
• Utišavanje transpozona (ili histonske modifikacije)
• Utišavanje transgena
• Položajnik efekat
• RNK-usmjerena DNK metilacija

Posttranskripcija

• RNK interferencija
• RNK utišavanje
• Nlnsens posredovano propadanje

Mejotski

• Transvekcija
• Mejotsko utišavanje neuparene DNK

Metodi istraživanja

Antisens oligonukleotidi

Antisens oligonukleotide otkrili su Paul Zamečnik i Mary Stephenson, 1978.^[5] Oligonukleotidi, koji su kratki fragmenti nukleinske kiseline, vezuju se za komplementarne molekule ciljne RNK kada se dodaju u ćeliju.^[5][6] Ove molekule mogu biti sastavljene od jednolančane DNK ili RNK i obično imaju 13-25 nukleotida.^[6][7] Antisensni oligonukleotidi mogu uticati na ekspresiju gena na dva načina: korištenjem mehanizma ovisnog o enzimu Rnaza H ili korištenjem mehanizma sternog blokiranja.^[6][7] Oligonukleotidi zavisni od RNaze H uzrokuju razgradnju ciljnih molekula iRNK, dok sterni blokatorski oligonukleotidi sprečavaju translaciju molekula iRNK.^[6][7] Većina antisens lijekova funkcionira putem mehanizam ovisnog o RNazi H, u kojem Rnaza H hidrolizira RNK lanac heterodupleksa DNK/RNK.^[6][7] izraz.^[6]

Ribozimi

Opći mehanizam koji ribozimi koriste za cijepanje molekula RNK

Ribozimi su katalitske molekule RNK koje se koriste za inhibiciju ekspresije gena. Ove molekule rade tako što cijepaju molekule iRNK, u suštini utišavajući gene koji su ih proizveli. Sidney Altman i Thomas Cech prvi su otkrili katalitske molekule RNK, RNazu P i intron ribozimske grupe II, 1989. godine i dobili Nobelovu nagradu za svoje otkriće.^[8][9] Postoji nekoliko tipova ribozimskih motiva, uključujući čekićasti, ukosnički, hepatitisni delta virus, grupa I, grupa II i RNaza P ribozimi. Motivi ribozima virusa čekičara, ukosnice i virusa hepatitisa delta (HDV) općenito se nalaze u virusima ili viroidnim RNK.^[8] Ovi motivi su u stanju da samo-cijepaju specifičnu fosfodiestarsku vezu na mRNA molekulu.^[8] Donji eukarioti i nekoliko bakterija sadrže ribozime grupe I i grupe II.^[8] Ovi motivi mogu se sami spajati cijepanjem i spajanjem fosfodiestarskih veza.< ref name=phyl/> Posljednji motiv ribozima, RNazni P ribozim, nalazi se u Escherichia coli i poznat je po svojoj sposobnosti da cijepa fosfodiestarske veze nekoliko tRNK prekursora kada se spoje na proteinski kofaktor.^[8]

Opčii katalitski mehanizam koji koriste ribozimi sličan je mehanizmu koji koriste proteinske ribonukleaze.^[10] Ove katalitske molekule RNK vežu se na određeno mjesto i napadaju susjedni fosfat u kičmi RNK sa svojim 2' kisikom, koji djeluje kao nukleofil, što rezultira stvaranjem rascjepanih proizvoda s 2'3'-cikličkim fosfatom i 5' hidroksilni krajnji kraj.^[10] Sve više se koristi ovaj katalitskki mehanizam za izvođenje cijepanja ciljanih molekula iRNK specifične za sekvencu. Osim toga, pokušavaju se koristiti ribozimi za proizvodnju terapeutika za utišavanje gena, koji bi utišali gene koji su odgovorni za izazivanje bolesti.^[11]

Interferencija RNK

Lijevo: Pregled interferencije RNK

Interferencija RNK (RNKi) je prirodni proces koji koriste ćelije za regulaciju ekspresija gena. Otkrili su ga 1998. Andrew Fire i Craig Mello, koji su za svoje otkriće dobili Nobelovu nagradu 2006.^[12] Proces utišavanja gena prvo počinje ulaskom molekula dvolančane RNK (dsRNA) u ćeliju, koja pokreće RNKi put.^[12] Dvolančana molekula je tada izrezana na male dvolančane fragmente enzimom zvanim Dicer.^[12] Ovi mali fragmenti, koji uključuju male interferirajuće RNK (siRNA) i mikroRNK (miRNK), dužine su otprilike 21-23 nukleotida.^[12][13] Fragmenti se integriraju u protein s više podjedinica nazvan RNA-inducirani kompleks utišavanja, koji sadrži argonautne proteine koji su esencijalne komponente RNKi puta.^[12][13] Jedan lanac molekule, nazvan "vodič"-lanac, vezuje se za RISC, dok je drugi lanac, poznat kao "putnički" lanac, degradiran.^[12][13] Vodeći ili antisens lanac fragmenta koji ostaje vezan za RISC usmjerava utišavanje ciljne molekule iRNK specifično za sekvencu.^[13] Geni mogu biti utišani molekulama siRNK koje uzrokuju endonukleazno cijepanje ciljnih molekula iRNK ili molekulama miRNK koje potiskuju translaciju molekula iRNK.^[13] S cijepanjem ili translacijskom represijom molekula iRNK, geni koji ih formiraju postaju u suštini neaktivni.^[12] Smatra se da su RNKi evoluirali kao ćelijski odbrambeni mehanizam protiv napadača, kao što su RNK-virusi , ili za borbu protiv proliferacije transpozona unutar čelijske DNK.^[12] I RNK virusi i transpozoni mogu postojati kao dvolančana RNK i dovesti do aktivacije RNKi.^[12] Uočeno je da se siRNK široko koristi za suzbijanje specifične ekspresije gena i za procjenu funkcije gena. Kompanije koje koriste ovaj pristup uključuju Alnylam, Sanofi,^[14] Arrowhead, Discerna,i Persomics, između ostalih.

Tri primarne neprevedene regije i mikroRNK

Glavni članak: Tri primarna neprevedena regija

Glavni članak: MikroRNK

Tri prim neprevedena regija (3'UTR) iRNK (iRNK) često sadrže regulatorne sekvence koje posttranskripcijski uzrokuju utišavanje gena. Takvi 3'-UTR često sadrže i vezna mjesta za mikroRNK (miRNK) kao i za regulatorne proteine. Vezivanjem za specifična mjesta unutar 3'-UTR, veliki broj specifičnih miRNK smanjuje ekspresiju gena svoje određene ciljne mRNK ili inhibirajući translaciju ili direktno uzrokujući degradaciju transkripta , koristeći mehanizam sličan interferenciji RNK (vidi MikroRNK). 3'-UTR također može imati regije utišavanja koje vezuju represorske proteine za inhibiciju ekspresije iRNK.

3'-UTR često sadrži elemente odgovora mikroRNK(MRE-ove). MRE su sekvence za koje se vežu miRNA i uzrokuju utišavanje gena. Ovo su preovlađujući motivi unutar 3'-UTR. Među svim regulatornim motivima unutar 3'-UTR (npr. uključujući regije prigušivača), MRE čine otprilike polovinu motiva.

Od 2014. godine, miRBase web stranica,^[15] arhiva miRNK sekvenci i napomena, navodi 28.645 unosa u 233 biološke vrste. Od toga, 1.881 miRNK je bila u označenim ljudskim lokusima miRNK. Predviđeno je da svaka miRNK ima u prosjeku oko četiri stotine ciljnih mRNK (što uzrokuje utišavanje gena nekoliko stotina gena).^[16] Freidman et al.^[16] procjenjuju da je >45.000 miRNK ciljanih mjesta unutar ljudske iRNK 3'UTR konzervirano iznad nivoa pozadine, a >60% ljudskih proteina koji kodiraju geni je bilo pod selekcijskim pritiskom da održi uparivanje s miRNK .

Direktni eksperimenti pokazuju da jedna miRNK može smanjiti stabilnost stotina jedinstvenih iRNK.^[17] Ostali eksperimenti pokazuju da jedna miRNK može potisnuti proizvodnju stotina proteina, ali da je ta represija često relativno blaga (manje od 2 puta).^[18][19]

Čini se da su efekti miRNK disregulacije ekspresija gena važni kod kancera.^[20] Naprimjer, kod karcinoma gastrointestinalnog trakta, devet miRNK je identificirano kao epigenetički izmijenjenih i djelotvornih u smanjenju regulacije enzima popravka DNK.^[21]

Čini se da su efekti miRNK disregulacije ekspresije gena važni i kod neuropsihijatrijskih poremećaja, kao što su shizofrenija, bipolarni poremećaj, velika depresija, Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest i poremećaji iz autističkog spektra.^[22][23][24]

Aplikacije

Medicinsko istraživanje

Istraživači su naširoko koristili tehnike utišavanja gena za proučavanje gena povezanih s poremećajima. Ovi poremećaji uključuju rak, infektivne bolesti, respiratorne bolesti i neurodegenerativne poremećaje. Utišavanje gena se također koristi u naporima za otkrivanje lijekova, kao što su sintetskka smrtnost, visokopropusni skrining i minijaturizirani RNKi ekrani.

Kancer

Interferencija RNK je korištena za utišavanje gena povezanih s nekoliko vrsta raka. U in vitro studijama hronične mijelogene leukemije (CML), siRNK je korišten za cijepanje fuzijskog proteina, BCR-ABL, koji sprječava vezivanje Gleevecovog lijeka (imatinib) za ćelije raka.^[25] Cijepanjem fuzijskog proteina smanjena je količina transformiranih hematopoetskih ćelija koje se šire po tijelu povećanjem osetljivosti ćelija na lijek.^[25] Interferencija RNK se također može koristiti za ciljanje specifičnih mutanata. Naprimjer, siRNK su se mogle specifično vezati za molekule supresora tumora p53 koje sadrže jednu tačkastu mutaciju i uništiti je, ostavljajući divlji tip supresora netaknutim.^[26]

Receptori uključeni u mitogene puteve koji dovode do povećane proizvodnje ćelija raka tamo su također bili meta molekula siRNK. hemokinski receptor hemokinskog receptora 4 (CXCR4), povezan sa proliferacijom raka dojke, razdvojen je molekulama siRNK koje su smanjili broj podjela koje obično opažaju ćelije raka.^[27] Istraživači su također koristili siRNK da selektivno reguliraju ekspresiju gena povezanih s rakom. Antiapoptotski proteini, kao što su klasterin i survivin, često se eksprimiraju u ćelijama raka.^[28][29] Klasterin i siRNK ciljane na survivin korišteni su da se smanji broj antiapoptoznih proteina i na taj način poveća osjetljivost ćelija raka na hemoterapijske tretmane.^[29] Studije in vivo se takođe sve više koriste za proučavanje potencijalne upotrebe molekula siRNK u terapiji raka. Naprimjer, pronađeno je da miševi implantirani sa adenokarcinomom debelog crijeva ćelijama preživljavaju duže kada su ćelije prethodno tretirane siRNK koje su ciljale B-katenin u ćelijama raka.^[30]

Također pogledajgte

• CRISPR
• DNK-usmjerena interferencija RNK
• Genski pogon
• Gensku nokdaun
• PPRHs

Reference

1. Redberry, Grace (2006). Gene silencing : new research. New York: Nova Science Publishers. ISBN 9781594548321.
2. "Gene Silencing". National Center for Biotechnology Information. Pristupljeno 11. 11. 2013.
3. Hood E (mart 2004). "RNAi: What's all the noise about gene silencing?". Environmental Health Perspectives. 112 (4): A224–9. doi:10.1289/ehp.112-a224. PMC 1241909. PMID 15033605.
4. Mocellin S, Provenzano M (novembar 2004). "RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology". Journal of Translational Medicine. 2 (1): 39. doi:10.1186/1479-5876-2-39. PMC 534783. PMID 15555080.
5. Kole R, Krainer AR, Altman S (februar 2012). "RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides". Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (2): 125–40. doi:10.1038/nrd3625. PMC 4743652. PMID 22262036.
6. Dias N, Stein CA (mart 2002). "Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms". Molecular Cancer Therapeutics. 1 (5): 347–55. PMID 12489851.
7. Kurreck J (mart 2004). "Antisense and RNA interference approaches to target validation in pain research". Current Opinion in Drug Discovery & Development. 7 (2): 179–87. PMID 15603251.
8. Phylactou, L. (1. 9. 1998). "Ribozymes as therapeutic tools for genetic disease". Human Molecular Genetics. 7 (10): 1649–1653. doi:10.1093/hmg/7.10.1649. PMID 9735387.
9. Shampo MA, Kyle RA, Steensma DP (oktobar 2012). "Sidney Altman--Nobel laureate for work with RNA". Mayo Clinic Proceedings. 87 (10): e73. doi:10.1016/j.mayocp.2012.01.022. PMC 3498233. PMID 23036683.
10. Doherty EA, Doudna JA (1. 6. 2001). "Ribozyme structures and mechanisms". Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 30 (1): 457–75. doi:10.1146/annurev.biophys.30.1.457. PMID 11441810.
11. Tollefsbol, Trygve O., ured. (2007). Biological aging methods and protocols. Totowa, N.J.: Humana Press. ISBN 9781597453615.
12. "RNA Interference Fact Sheet". National Institutes of Health. Arhivirano s originala, 25. 11. 2013. Pristupljeno 24. 11. 2013.
13. Wilson RC, Doudna JA (2013). "Molecular mechanisms of RNA interference". Annual Review of Biophysics. 42: 217–39. doi:10.1146/annurev-biophys-083012-130404. PMC 5895182. PMID 23654304.
14. "Big Pharma's Turn On RNAi Shows That New Technologies Don't Guarantee R&D Success". Forbes. Pristupljeno 11. 10. 2015.
15. miRBase.org
16. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP (januar 2009). "Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs". Genome Research. 19 (1): 92–105. doi:10.1101/gr.082701.108. PMC 2612969. PMID 18955434.
17. Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, Grimson A, Schelter JM, Castle J, Bartel DP, Linsley PS, Johnson JM (februar 2005). "Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs". Nature. 433 (7027): 769–73. Bibcode:2005Natur.433..769L. doi:10.1038/nature03315. PMID 15685193. S2CID 4430576.
18. Selbach M, Schwanhäusser B, Thierfelder N, Fang Z, Khanin R, Rajewsky N (septembar 2008). "Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs". Nature. 455 (7209): 58–63. Bibcode:2008Natur.455...58S. doi:10.1038/nature07228. PMID 18668040. S2CID 4429008.
19. Baek D, Villén J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP, Bartel DP (septembar 2008). "The impact of microRNAs on protein output". Nature. 455 (7209): 64–71. Bibcode:2008Natur.455...64B. doi:10.1038/nature07242. PMC 2745094. PMID 18668037.
20. Palmero EI, de Campos SG, Campos M, de Souza NC, Guerreiro ID, Carvalho AL, Marques MM (juli 2011). "Mechanisms and role of microRNA deregulation in cancer onset and progression". Genetics and Molecular Biology. 34 (3): 363–70. doi:10.1590/S1415-47572011000300001. PMC 3168173. PMID 21931505.
21. Bernstein C, Bernstein H (maj 2015). "Epigenetic reduction of DNA repair in progression to gastrointestinal cancer". World Journal of Gastrointestinal Oncology. 7 (5): 30–46. doi:10.4251/wjgo.v7.i5.30. PMC 4434036. PMID 25987950.
22. Maffioletti E, Tardito D, Gennarelli M, Bocchio-Chiavetto L (2014). "Micro spies from the brain to the periphery: new clues from studies on microRNAs in neuropsychiatric disorders". Frontiers in Cellular Neuroscience. 8: 75. doi:10.3389/fncel.2014.00075. PMC 3949217. PMID 24653674.
23. Mellios N, Sur M (2012). "The Emerging Role of microRNAs in Schizophrenia and Autism Spectrum Disorders". Frontiers in Psychiatry. 3: 39. doi:10.3389/fpsyt.2012.00039. PMC 3336189. PMID 22539927.
24. Geaghan M, Cairns MJ (august 2015). "MicroRNA and Posttranscriptional Dysregulation in Psychiatry". Biological Psychiatry. 78 (4): 231–9. doi:10.1016/j.biopsych.2014.12.009. PMID 25636176. S2CID 5730697.
25. Chen J, Wall NR, Kocher K, Duclos N, Fabbro D, Neuberg D, Griffin JD, Shi Y, Gilliland DG (juni 2004). "Stable expression of small interfering RNA sensitizes TEL-PDGFbetaR to inhibition with imatinib or rapamycin". The Journal of Clinical Investigation. 113 (12): 1784–91. doi:10.1172/JCI20673. PMC 420507. PMID 15199413.
26. Martinez LA, Naguibneva I, Lehrmann H, Vervisch A, Tchénio T, Lozano G, Harel-Bellan A (novembar 2002). "Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23): 14849–54. Bibcode:2002PNAS...9914849M. doi:10.1073/pnas.222406899. PMC 137507. PMID 12403821.
27. Lapteva N, Yang AG, Sanders DE, Strube RW, Chen SY (januar 2005). "CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo". Cancer Gene Therapy. 12 (1): 84–9. doi:10.1038/sj.cgt.7700770. PMID 15472715. S2CID 23402257.
28. July LV, Beraldi E, So A, Fazli L, Evans K, English JC, Gleave ME (mart 2004). "Nucleotide-based therapies targeting clusterin chemosensitize human lung adenocarcinoma cells both in vitro and in vivo". Molecular Cancer Therapeutics. 3 (3): 223–32. doi:10.1158/1535-7163.223.3.3. PMID 15026542. S2CID 37703422.
29. Ning S, Fuessel S, Kotzsch M, Kraemer K, Kappler M, Schmidt U, Taubert H, Wirth MP, Meye A (oktobar 2004). "siRNA-mediated down-regulation of survivin inhibits bladder cancer cell growth". International Journal of Oncology. 25 (4): 1065–71. doi:10.3892/ijo.25.4.1065 (neaktivno 31. 12. 2022). PMID 15375557.
30. Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB (april 2003). "Small interfering RNAs directed against beta-catenin inhibit the in vitro and in vivo growth of colon cancer cells". Clinical Cancer Research. 9 (4): 1291–300. PMID 12684397.

Vanjski linkovi

• RNAiAtlas - database of siRNA libraries and their target analysis resultsArhivirano 10. 2. 2015. na Wayback Machine.
• Science project: Transgenic apple varieties Approaches to preventing outcrossing – possible effects on micro-organisms
• Gene silencing na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• Research project: New Cost-effective method for gene silencing
• van Leeuwen F, Gottschling DE (2002). "Assays for gene silencing in yeast". Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology - Part B. Methods in Enzymology. 350. str. 165–86. doi:10.1016/S0076-6879(02)50962-9. ISBN 9780121822538. PMID 12073311.

Šablon:Regulacija ekspresije gena